黃芩苷對人肺腺癌A549細胞的抑制作用及相關機制

鄭海峰，王英妹，武鐵軍，李慶祥，張 健，段國辰

（1.邢臺市第三醫院胸外科，河北 邢臺 054000；2.邢臺市第三醫院神經內科，河北 邢臺 054000；3.河北省人民醫院胸外科，河北 石家莊 050051）

常用的化療藥物雖然具有抑制腫瘤細胞的作用，但毒副作用也相對較大，長期使用易產生耐藥性。目前抗癌藥物的研究已逐漸轉向天然動植物，我國傳統的中醫中藥已越來越受到人們的青睞，中醫中藥治療腫瘤已成為腫瘤治療領域的一大特色。黃芩苷 (baicalin)是一種黃酮類化合物，是黃芩的主要有效成分，具有抗氧化、誘導干細胞分化、神經保護、抗血管增殖、抗菌等藥理作用［1-5］。有研究表明，黃芩苷能夠抑制黏液表皮樣癌腫瘤細胞增殖，促進腫瘤細胞凋亡，具有顯著的抗腫瘤作用［6］。本研究觀察了黃芩苷體外對肺腺癌細胞株A549凋亡相關因子表達的影響，探討黃芩苷是否具有抑制A549細胞的作用及其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 肺腺癌A549細胞株細胞購自中國科學院上海細胞研究所；黃芩苷購自南京青澤醫藥公司，純度:99.1%；Trizol購自Invitrogen公司；胎牛血清、RPMI 1640培養液和胰蛋白酶購自美國 Gibco公司；Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司設計并合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 肺腺癌A549細胞株培養于RPMI 1640培養液，含10%小牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素，置37℃、CO2孵箱內培養傳代。

1.2.2 MTT法檢測細胞抑制率 取對數生長期的肺腺癌細胞A549，按1×104/孔接種于96孔板內。以倍比稀釋的方法由高到低分別加入不同濃度的黃芩苷 (10、5、2.5、1.25、0.625、0 mg/L)，藥物分別作用24、48、72 h，加入MTT(每孔終質量濃度為0.5 g/L)，繼續培養4 h后，吸去上清液，加入二甲基亞砜 (DMSO)100 μL，振蕩，充分溶解后，用酶標儀490 nm波長下測定各孔OD值，按下述公式計算細胞生長抑制率。抑制率%=(1－實驗組OD值/對照組OD值)×100%。每組6個復孔，實驗重復3次。SPSS 11.5統計軟件計算細胞生長抑制50%的藥物濃度 (IC50)值及10%的藥物抑制濃度 (IC10)值。

1.2.3 RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA的表達 實驗分2組:對照組 (培養液)、黃芩苷 (1.22 mg/L)作用組，作用24 h后，Trizol一步法提取細胞總RNA，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，并以紫外分光光度法測定RNA的純度及含量。按照試劑盒說明書，各樣品分別取2 μg RNA用于逆轉錄。每樣品分別取1 μL逆轉錄產物建立PCR反應體系。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶 (GAPDH)作為內參照基因。PCR反應參數為:95℃5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，進行30個循環；72℃延伸反應10 min。引物序列如下:Caspase-3:上游5'-GGACAACAACGAAACCTCCG-3'，下游5'-CTCCACTGGTATCTTCTGGCA-3'，PCR片段為568 bp；Bcl-2:上游5'-AGAGGGGCTACGAGTGGGAT-3'，下游5'-TCAAA GAAGGC CACAATCCTC-3'，PCR片段為373 bp；Bax:5'-GAGGATGATTGCTGACGTGGA-3'，5'-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3'，PCR片段為337 bp；內參照GAPDH:上游5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下 游 5'-TCCACCACCCTGTTGCTG-3'，PCR片段為452 bp。PCR產物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀進行DNA電泳條帶分析，以目的基因與GAPDH的光密度比值表示其mRNA表達水平。

1.2.4 統計學處理 實驗數據用SPSS 11.5統計軟件進行統計分析。計量資料用 ()表示，兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT法檢測細胞抑制率 不同處理組分別培養24、48、72 h，黃芩苷對A549敏感細胞生長均有抑制作用，并且具有量效、時效關系。見圖1。黃芩苷作用A549細胞IC10值分別為:1.22、0.71、0.65 mg/L，IC50值分別為:7.38、5.04、3.94 mg/L，確定細胞抑制率≤10%的濃度為非細胞毒性濃度，因此選黃芩苷質量濃度為1.22 mg/L作用24 h作為試驗的安全劑量。

圖1 黃芩苷對A549細胞的抑制作用

2.2 黃芩苷對A549細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表達的影響 RT-PCR結果顯示:與對照組細胞相比，黃芩苷處理組Bax、Caspase-3 mRNA表達水平顯著升高 (P＜0.01)，Bcl-2 mRNA表達水平顯著下降 (P＜0.01)，Bcl-2/Bax比值顯著降低 (P＜0.01)。見表1，圖2。

表1 黃芩苷對A549細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3基因表達的影響(RF-PCR結果)(x ± s，n=6)

圖2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達的變化

3 討論

肺腺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在我國，肺腺癌死亡居惡性腫瘤首位［7］，同時，由于缺乏有效的早期發現手段，中晚期病例5年生存率僅約10%［8］，化療依然是肺腺癌治療的主要手段之一，但不良反應及多藥耐藥的形成嚴重影響化療效果和患者生存質量，是臨床肺腺癌化療失敗的重要原因，而中醫中藥恰恰彌補了這些不足。中醫認為肺癌是由于邪毒內侵、肺絡受損、氣血虛弱、痰瘀阻肺導致的。因此，針對病機結合中藥治療以提高化療效果、減輕毒副反應已成為當前臨床研究的熱點。

黃芩為唇形科植物，其干燥根味苦，性寒。歸肺、膽、脾、大腸、小腸經，具有清熱燥濕，瀉火解毒，止血，安胎等功效。黃芩苷是從黃芩中分離出來的黃酮類化合物，是中藥黃芩的主要有效成分，具有多種藥理作用［1-5］。也有研究表明，黃芩苷能抑制Mc3腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞分化及促進調亡［6］。本研究通過MTT法試驗證實，黃芩苷能夠顯著抑制A549細胞生長，提示其對肺腺癌細胞具有明顯的抑制作用。

為了探討黃芩苷對肺腺癌細胞抑制作用的機制，我們進一步檢測了凋亡相關因子Bcl-2、Bax、Caspase-3的表達，探討黃芩苷對肺腺癌細胞影響的機制。Caspase-3被認為是哺乳動物細胞凋亡的關鍵蛋白酶，所以，本實驗對肺腺癌A549細胞Caspase-3的表達進行了檢測。結果發現，黃芩苷作用后，細胞Caspase-3表達水平升高，提示黃芩苷具有促進肺腺癌SGC27901細胞凋亡的作用。Bcl-2、Bax是細胞凋亡過程中的一類重要調節因子，Bcl-2位于核膜、粗面內質網及線粒體膜上，其主要生物學功能為延長細胞壽命，增加細胞對多種凋亡刺激因素的抵抗性［9］，Bcl-2作為凋亡抑制蛋白，除可通過多種途徑抑制凋亡，還可導致腫瘤MDR［10］，本研究顯示，A549細胞中Bcl-2基因表達量在黃芩苷作用后明顯下降，提示黃芩苷可通過抑制Bcl-2表達逆轉腫瘤細胞的凋亡抵抗。與Bcl-2相同，Bax位于線粒體膜、內質網膜和核膜的胞質面上，是Bcl-2的同源體，能與Bcl-2形成異源二聚體，抑制Bcl-2作用。Bcl-2/Bax也能形成同源二聚體，抑制線粒體細胞色素C釋放，促進細胞凋亡［11］。本研究發現，黃芩苷作用后A549細胞Bax表達明顯增強，Bcl-2/Bax比值顯著降低，說明該藥可使腫瘤細胞易于凋亡。

本研究初步證實黃芩苷可誘導肺腺癌細胞凋亡，具有抑制肺腺癌的生長作用。但本研究僅檢測了凋亡相關因子mRNA水平的表達變化，具體的轉導機制尚未深入研究；另外，應進行體內實驗予以驗證體外實驗結果，以期更好的為黃芩苷誘導肺腺癌細胞凋亡、改善肺腺癌治療效果提供理論依據。

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