RP-HPLC法測定蒼耳子中蒼術苷

劉玉紅，朵 睿，2，黃 蛟，王明奎，易進海*

（1.四川省中醫藥科學院，四川 成都 610041；2.瀘州醫學院，四川 瀘州，646000；3.中國科學院成都生物所，四川 成都 610041）

蒼耳子是菊科植物蒼耳Xanthium sibiricum Patr.的干燥成熟帶總苞的果實，具有散風寒、通鼻竅、祛風濕之功效，用于風寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵等癥，是鼻淵之要藥［1］，為臨床常用有毒中藥。《本草品匯精要》記載蒼耳子“有毒”。《南方主要有毒植物》記載: “蒼耳，有毒部位，全株；以果實為最毒”。因蒼耳服用過量或炮制不當引起的中毒甚至死亡的病例時有發生［2-3］，病理特征表現為動物和人在誤食一定量后出現血糖下降，昏迷，嚴重者出現腎衰竭甚至死亡；慢性中毒多因初服時未出現明顯的不良反應而長期服用，結果導致蓄積中毒，引起心肌及肝功能損害［4］。現代化學和毒理研究表明蒼耳子的毒性成分主要為水溶性苷類成分:蒼術苷(atractyloside)與羧基蒼術苷(carboxyatractyloside)以及其它苷類衍生物等［5］。蒼術苷及羧基蒼術苷可抑制體內ADP/ATP對蛋白的轉運，并帶來嚴重的血糖下降，從而導致體內代謝紊亂［6-8］，與蒼耳子中毒的表現一致，因此被認為是蒼耳子的主要毒性成分。建立蒼耳子中蒼術苷的測定方法，對蒼耳子的毒性成分進行監控，保證臨床用藥安全是十分必要的。蒼耳子中蒼術苷的測定尚未見文獻報道，其它樣品中蒼術苷的測定方法文獻報道有酶聯免疫法［9］、TLC斑點測試［10］、GC-MS［11］、HPLC-ELSD［12］、LC-API-MS［13］等，這些方法在定量的準確性或方法的普適性方面存在一定的局限。本實驗首次建立了RP-HPLC測定蒼耳子中蒼術苷的方法，該方法簡便、快速，重復性好，為控制蒼耳子的質量和毒性提供了參考。

1 材料

Agilent 1200型高效液相色譜儀 (包括四元泵，DAD檢測器，柱溫箱，自動進樣器，工作站)；KQ—100超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司)，Mettler Toledo XS205型電子天平 (瑞士)，Millipore Milli-Q超純水系統 (美國)。

實驗樣品購于四川、遼寧、山東、河北、內蒙古、新疆、甘肅等地共35批蒼耳子藥材和飲片，由四川省中醫藥科學院舒光明研究員鑒定。蒼術苷對照品自制，純度為98.1%，經理化性質和光譜數據分析，鑒定其結構。乙腈為美國Fisher色譜純；水為Millipore Milli-Q超純水系統制得的超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱；流動相為乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液 (20∶80)；體積流量1.0 mL/min；檢測波長203 nm；柱溫35℃。對照品溶液及供試品溶液的色譜圖見圖1。同時對樣品中蒼術苷的200～400 nm紫外光譜圖與對照品的紫外光譜圖進行比較，表明樣品峰無其它雜質干擾。

圖1 蒼術苷對照品 (A)及蒼耳子供試品 (B)的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of atractyloside(A)and Xanthii Fructus(B)

2.2 對照品溶液的制備 精密稱取蒼術苷對照品11.29 mg，置10 mL量瓶中，加10%甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻。再精密量取上述對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加10%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含蒼術苷0.1129 mg的對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取蒼耳子粉未 (過三號篩)1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加水20 mL，精密稱定質量，超聲 (功率250 W，頻率40 kHz)處理40 min，取出，放冷，再稱定質量，用水補足減失質量，離心 (12000 r/min，5 min)，取上清液作為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系 精密吸取蒼術苷對照品各1、3、6、9、12、15、20 μL，注入液相色譜儀中，以進樣量 (μg)為橫坐標，對照品峰面積 (A)為縱坐標，繪制標準曲線。結果蒼術苷的標準曲線為Y=458.9X-3.884(r=0.9999)，線性范圍為0.1129 ～2.258 μg。

2.4.2 定量限和檢出限 將2.2項下的溶液，用10%甲醇溶液稀釋成0.01129 mg/mL的溶液，進樣測定，按10倍和3倍信噪比計算出蒼術苷的定量限和檢出限分別約為34 ng、11.3 ng。

2.4.3 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液(樣品01)10 μL，注入液相色譜儀，連續進樣5次，按2.1項下色譜條件測定，蒼術苷的峰面積的RSD為0.58%，表明儀器精密度好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(樣品01)10 μL，注入液相色譜儀，分別于0、1、4、8、24 h檢測，記錄色譜圖，蒼術苷的峰面積的RSD為0.83%，表明供試品溶液于24 h內穩定。

2.4.5 重復性試驗 取同一蒼耳子 (樣品01)粉未，精密稱取約1 g，共5份，按2.3項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，計算出蒼術苷質量分數為2.14 mg/g、RSD為1.0%，表明該方法重復性好。

2.4.6 加樣回收試驗 取已知蒼術苷含有量的樣品 (樣品01，2.14 mg/g)，0.5 g，共6份，精密稱定，準確加入適量對照品，照2.3項下操作，測定，計算回收率。結果見表1。

表1 蒼術苷的加樣回收率實驗 (n=6)Tab.1 Recovery of atractyloside

2.5 樣品測定 照2.3項下方法制備35批次蒼耳子樣品的供試品溶液，分別精密吸取10～20 μL注入液相色譜儀測定，在2.1項色譜條件下進行測定，計算各樣品中蒼術苷，結果見表2。

3 討論

3.1 提取溶劑和樣品制備方法的考察 蒼術苷為水溶性苷類。本實驗比較了水、25%甲醇、50%甲醇對蒼術苷超聲提取的效果，3種溶劑測定同一樣品的含有量分別為0.214%、0.191%，0.0723%，表明不同溶劑提取對蒼術苷有顯著影響，以水提取效果最佳。又以水為提取溶劑，比較了超聲提取30、40、60 min的差異，結果表明提取 40 min即可。

表2 蒼耳子樣品中蒼術苷的測定結果 (n=3)Tab.2 Contents of atractyloside in Xanthii Fructus

3.2 色譜條件的選擇和優化

3.2.1 流動相系統的篩選 參照文獻［13］，采用甲醇-醋酸鹽緩沖液系統，結果基線噪音太大，該系統不適合紫外檢測器短波長檢測。又自行摸索比較了甲醇-磷酸水、乙腈-磷酸水、乙腈-磷酸鹽等系統，結果以乙腈-磷酸鹽系統較好，但仍存在色譜峰拖尾嚴重的問題，故對不同色譜柱的分離效果進行比較。

3.2.2 色譜柱的篩選 比較了Phenomenex LUNA C18(2)(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，Agilent Eplise XDB-C18柱 (4.6 mm ×250 mm，5 μm)，親水性C18柱 Phenomenex Gemini C18110A(4.6 mm×250 mm，5 μm)，苯基柱 Agilent ZORBAX SB-phenyl(4.6 mm×250 mm，5 μm)的分離效果，結果以苯基柱分離效果最佳，峰形較為對稱。

3.2.3 測定波長的選擇 蒼術苷為貝殼杉烯苷類化合物，DAD掃描可見僅有末端吸收，故采用203 nm為測定波長，結果表明靈敏度較高，待測成分基線分離，重現性良好，符合定量測定的要求。

3.3 測定結果 35批次蒼耳子藥材及飲片的測定結果，表明不同來源蒼耳子中蒼術苷的含有量差異很大，有必要制定蒼術苷的限量標準。有報道稱南方產蒼耳子低毒，北方產蒼耳子毒性較大，本實驗測定結果與此結論有相同趨勢。

［1］馬 萍，李 紅.蒼耳子的研究進展［J］.中草藥，1999，30(8):634.

［2］張學梅，張重華.蒼耳子中毒及毒性研究進展［J］.中西醫結合學報，2003，51(1):71.

［3］閻芳華.過量服用蒼耳子中毒致死一例［J］.山西醫藥雜志，2007，36(3):212.

［4］梁曉燕，朱會友，王建麗，等.小劑量蒼耳子中毒1例［J］.實用中醫藥雜志，1998，14(10):45.

［5］汪 洋.中藥蒼耳子的毒性物質基礎及中毒機制研究［D］.上海:第二軍醫大學，2010

［6］Obatomi D K，Bach P H.Biochemistry and toxicology of the diterpenoid glycoside atractyloside［J］. Food Chem Toxicol，1998，36(4):335-346.

［7］Klingenberg M.The ADP，ATP shuttle of the mitochondrion［J］.Trends Biochem Sci，1979，4(11):249-252.

［8］阮貴華，李攻科.蒼耳子的化學成分及其分離分析研究進展［J］.中成藥，2008，30(3):421.

［9］Bye S N，Coetzer T H T，Dutton M F.An enzyme immunoassay for atractyloside，the nephrotoxin of Callilepis laureola(Impila)［J］.Toxicon，1990，28(8):997-1000.

［10］Steenkamp V，Stewart M J，Zuckerman M.Detection of poisoning by Impila(Callilepis laureola)in a mother and child［J］.Human ExpToxicol，1999，18(10):594-597.

［11］Laurens J B，Bekker L C，Steenkamp V，et al.Gas chromatographic-mass spectrometric confirmation of atractyloside in a patient poisoned with Callilepis laureola［J］.J Chromatogr B，2001，765(2):127-133.

［12］Stafford C G，St Claire R L 3rd.High-performance liquid chromatographic analysis of the lactone and carboxylate forms of a topoisomerase I inhibitor(the antitumor drug G1147211)in plasma［J］.J Chromatogr B Biomed Appl，1995，663(1):119-126.

［13］Steenkamp P A，Harding N M，van Heerdeen F R，et al.Determination of atractyloside in Callilepis laureola using solid-phase extraction and liquid chromatography-atmospheric pressure ionization-mass spectrometry［J］.J Chromatogr A，2004，1058(1/2):153-162.