總有機碳法用于復方丹參裝囊滴丸清潔驗證的可行性研究

周慶凱，孫 巍，曹鳳蘭，杭太俊

（1.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198；2.天津天士力制藥股份有限公司，天津 300402）

1 引言

藥品的清潔驗證就是對現行的清潔程序進行規定，并驗證現行的清潔規程能否一如既往的達到良好的清潔效果。也就是通過對擦拭取樣與淋洗取樣的檢測，來確定殘留量，從而驗證清潔方法是否能將殘留物清潔至標準值以下。

總有機碳 (Total Organic Carbon，以下簡稱TOC法)檢測方法用于純化水和注射用水的檢測早在20世紀90年代就已被美國和歐洲藥典先后收錄，我國在《中國藥典》2005年版也對該方法進行了收錄。TOC方法是通過對水中的有機物進行氧化，使有機物中的碳轉化為二氧化碳，并通過檢測二氧化碳的量，來計算水中有機物的量。TOC檢測方法之所以能夠用來檢測水質，就是因為TOC法能夠較為精確的確定水中的有機物是否超出標準。從而達到檢測水質的目的。根據相同原理，TOC檢測方法同樣可以用于清潔驗證。

1.1 中藥產品清潔驗證所面臨的挑戰 西藥產品由于自身成分單一，毒理學數據全面，清潔驗證過程相對簡單，且已經形成了一套完善的標準建立方法［1］。但對于中藥產品清潔驗證仍然存在挑戰。

首先，中藥產品成分復雜，一種中藥產品往往存在著成百上千種不同的成分，其中大部分成分為痕量，想要對殘留的每一種成分都進行定量是不現實的。

其次，中藥缺少毒理學數據。西藥復方產品清潔驗證往往是選擇其中活性最大或者是最難清潔的物質作為標志物，通過控制標志物的量，確定標志物的殘留量低于所設立的標準，來達到控制殘留，驗證清潔效果的目的。但是對于中藥來說，毒理學數據的缺少導致很難，甚至是無法確定清潔標志物，這就造成了我們無法完全借鑒西藥清潔驗證的經驗。而毒理學數據的缺少也會對中藥清潔驗證限度的建立造成影響。

再次，對于中藥來說，尤其是對于準備走出國門的中藥產品來說，國外的清潔驗證標準較為嚴格［2］，對試驗數據的要求也更高。對于植物藥，中國傳統中藥，國外一直保持謹慎的態度，中藥想要走出國門，就需要提供足夠的數據，這對中藥產品來說無疑是存在困難的。而就清潔驗證來言，需要提供方法的原理，可行性，限度的建立，依據等等相應數據。對于中藥來說，國外嚴格的清潔驗證標準，全面的數據需求，都對中藥的清潔驗證提出了挑戰。

最后，目前常用的清潔驗證方法不能滿足中藥清潔驗證的需要［3］。中藥常用的清潔驗證檢測方法為HPLC法，UV法等［4］，UV法僅能對存在共軛基團的化合物產生響應，靈敏度低，檢測存在局限性。HPLC法的靈敏度雖然較UV法高，但其仍然不能滿足清潔驗證痕量檢測的需要，且使用HPLC檢測時，由于樣品中存在多種物質，可能在HPLC色譜圖中出現未知雜峰，而FDA需要對未知峰進行解釋，可見目前常用的檢測方法對于中藥產品清潔驗證均存在局限性［5］。

1.2 TOC法的優勢 TOC檢測法為非專屬性方法，檢測范圍廣，響應物質多［6］。中藥制劑所含成分大多為蛋白質，纖維素，糖類，生物堿類，皂苷類，揮發油類，有機酸類，鞣質等，傳統的清潔驗證方法如HPLC法，UV法，GC法，滴定法等，一般僅能對其中某一種或者某一類成分進行定量檢測。而TOC檢測法為非專屬性方法，能對所有含碳的有機物產生響應值，而非某一種或者某一類物質。上述物質均為含有有機碳的有機物。TOC法通過對于總有機碳量進行限度設置，檢測總有機碳量，判斷其是否低于標準從而達到驗證清潔效果的目的。將中藥產品中所含全部有機物視為一個整體進行限量，既可以達到良好的清潔驗證效果，又可以有效地回避清潔標志物無法確定，未知峰無法解釋的問題。

TOC法的應用并不受限于毒理學數據。因為TOC法對有機物中的碳具有專屬性，無需尋找清潔標志物，而限度的制定，也可以根據多批次樣品檢測進行的數據積累而從經驗角度制定。這樣就解決了中藥產品毒理學數據的不足所引起的問題。

TOC法具有滿足痕量檢測的靈敏度。它對于有機碳的靈敏度可達1×10－9，比傳統檢測方法靈敏度高1×102～1×103倍，可以滿足中藥產品對于痕量檢測的要求，而且由于是將所有有機物視為一個整體進行檢測，可以較好的回避無法對每一種殘留物質均進行定量的難題。

由此可見，TOC法理論上可以解決中藥清潔驗證所面臨的難題，應該是一種比較科學，高效的清潔驗證方法。

2 儀器與試劑

2.1 儀器 GE sievers 900實驗室型總有機碳分析檢測儀；Waters AcquityTMUPLC分析儀。

2.2 試劑 蔗糖對照品 (中國藥品生物制品檢定所，批號 111507-200001)；1，4-對苯醌標準品(Dr.Enrenstorfer，批號Cl0537000)；磷酸 (天津市化學試劑三廠，批號20090606)；碳酸鈉 (天津市風船化學試劑科技有限公司，批號20050428)。

2.3 供試品 復方丹參裝囊滴丸 (生產廠家:天士力股份有限公司，批號:DP006002031)。

3 實驗與結果

3.1 方法學驗證 TOC方法也是分析檢測方法，所以也要通過方法學的驗證后才能應用于實際檢測［5］。人用藥物注冊技術要求國際協調會對于方法學實驗的相應指導原則簡稱ICH Q2B［7］為其提出了實驗內容。筆者以復方丹參裝囊滴丸為例，對TOC檢測法的線性，精密度，準確度，檢測限與定量限，穩定性，耐用性，殘留物回收率等進行方法學驗證。經過試驗 (儀器為GE Sievers 900實驗室型總有機碳分析檢測儀)，得到如下數據:

線性［8］:使用蔗糖對照品 (批號 111507-200001中國藥品生物制品檢定所)適量，加入適量超純水，溶解，定容，配置成TOC質量濃度約為50000 μg/L標準溶液，用超純水分別稀釋適宜倍數，分別對溶液編號為1～6，檢測超純水空白與1～6號溶液的TOC值，繪制線性散點圖。

結果:超純水空白為84.6 μg/L，線性方程為y=1.0071x，相關系數r=0.9999，范圍為200～25000 μg/L。

精密度:對于復方丹參裝囊滴丸清潔驗證樣品1連續檢測6次，計算RSD，結果RSD為0.466%

重復性:制作復方丹參裝囊滴丸樣品6份，編號為1～6，依次進行總有機碳檢測，計算RSD。結果RSD為1.540%

準確度:檢測6份復方丹參裝囊滴丸樣品的總有機碳濃度，加入已知總有機碳濃度的蔗糖對照品溶液，計算回收率與回收率RSD。結果:平均回收率為100.25%，RSD為2.37%

檢測限與定量限:對空白超純水溶液進行10次檢測，計算10次結果的標準偏差σ，檢測限=3.3 σ/k，定量限=10 σ/k，k=線性方程的斜率。結果:空白超純水樣品標準偏差為0.83，線性方程斜率為1.0071，檢測限為2.72 μg/L，定量限為8.24 μg/L。

穩定性:取復方丹參裝囊滴丸樣品，分別于0、2、4、6、8、24 h進行TOC檢測。觀察結果變化。結果:24 h內檢測結果未發生顯著變化。

耐用性:取已知有機碳濃度的蔗糖與1，4-對苯醌對照品，分別用磷酸及碳酸鈉調節樣品為pH4，pH7，pH10，進行 TOC檢測。觀察結果變化。結果:pH的改變未對結果產生顯著影響。

取樣回收率［9］:取生產設備表面相同材質鋼板，面積為10 cm×10 cm，6塊，分別滴加100 μL、200 μL、500 μL、750 μL、1 mL、1.5 mL 的配制好的復方丹參裝囊滴丸溶液，待其自然晾干后，使用規定的TOC擦拭專用棉簽按規定的方法擦拭鋼板表面，將棉簽折斷于裝有40 mL超純水的低TOC取樣瓶中，將樣品分別編號為1～6。按編號順序上樣檢測總有機碳質量濃度。分別取等量復方丹參裝囊滴丸溶液置于裝有空白擦拭棉簽與40 mL超純水的低TOC取樣瓶中，上樣檢測總有機碳質量濃度，計算回收率。結果:擦拭回收率65.8% ～73.5%RSD為5.2%

驗證結論:TOC檢測方法各項驗證結果均符合方法學驗證規定［10］，其殘留物回收率項證明了該取樣方法對復方丹參裝囊滴丸具有較好的回收率，證實了該方法可以作為復方丹參裝囊滴丸的清潔驗證方法。

3.2 TOC方法與UPLC方法應用于清潔驗證實例的對比 目前，天津天士力股份公司復方丹參裝囊滴丸的含量測定方法采用超高效液相色譜法 (UPLC)方法，該方法可對復方丹參裝囊滴丸中8個主要成分進行定量檢測。其檢測限根據各成分的不同最低可達50 μg/L，該方法應用于定量測定可以達到很好的檢測效果，但應用于清潔驗證卻仍存在著局限性，首先，清潔驗證屬于痕量檢測，UPLC方法的靈敏度仍不足以達到要求，其次，清潔驗證不僅需要檢測藥品的殘留，還要同時關注輔料，清潔劑等其他應用于生產，清潔等過程的原料的殘留。而UPLC方法因為對檢測物響應的限制，無法滿足以上要求。

TOC法，對有機碳的檢測限可達2 μg/L，而復方丹參裝囊滴丸產品中，無論是產品本身，還是輔料，清洗劑均屬于有機物，使用TOC方法可以同時對所有有機碳的殘留量進行檢測。通過限制殘留的有機碳的量，達到驗證清潔效果，控制藥品質量的作用。

以上，僅從理論上證實TOC法較UPLC法更適合作為復方丹參裝囊滴丸的清潔驗證方法。

通過對20個復方丹參裝囊滴丸生產線清潔驗證樣品分別使用TOC法與UPLC法進行檢測，比較檢測結果，見表1。

表1 20個取樣點TOC方法與UPLC方法檢測結果Tab.1 Results of cleaning validation of twenty sampling points with TOC and UPLC methods

由表1可見TOC方法可以準確地檢測出清潔驗證樣品中的有機碳殘余量，從而真實地反映出清潔效果。而UPLC方法由于靈敏度和檢測范圍的關系，無法真實地反映殘余情況，由此可見，對于復方丹參裝囊滴丸的清潔驗證來說，TOC方法確實更科學，更準確。

4 討論

通過以復方丹參裝囊滴丸為例證實，TOC法確實可以應用于中藥產品的清潔驗證中，但筆者發現，TOC檢測方法也有以下缺點。

TOC法對有機碳具有專屬性，如果殘留物中有可能存在無機活性成分，則TOC法無法對其產生響應值，這時候仍需要使用傳統專屬性方法，例如UPLC法，GC法等對該無機活性成分進行定量檢測；TOC法對于乙醇較為敏感。中藥生產中有些步驟必須使用乙醇，或者使用乙醇進行清潔，甚至整個過程都需要在乙醇中進行，使用TOC法有可能出現問題［11］；對于一些不溶或難溶于水的中藥，也不建議使用TOC法，TOC法可以準確地檢測出溶解于水中的有機物的總有機碳量，但對于不溶于水中的物質，則很難反映出真實的殘留情況。比如一些中藥中含有的難溶于水的油性化合物。雖然也可通過擦拭取樣回收，但檢測時可能會出現檢測結果RSD相差較大的情況［12］。綜上所述，TOC法對于水溶性中藥產品，是一種科學有效的清潔驗證方法。

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