柴苓湯對慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟細(xì)胞增殖的影響

王 霞， 孫東云， 王香婷， 王 箏， 王聰慧， 許慶友*

（1.河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 河北 石家莊 050091；2.河北醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，河北 石家莊 050091）

環(huán)孢素A(cyclosporine A，CsA)是目前用于器官移植抗排斥反應(yīng)以及自身免疫性疾病治療的一線藥物，但其腎毒性所導(dǎo)致的慢性損傷限制了它的長期臨床應(yīng)用。近30%的環(huán)孢素A長期使用者會出現(xiàn)顯著的腎毒性反應(yīng)［1］，其病理改變主要表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化。已有研究顯示腎間質(zhì)病變與細(xì)胞過度增殖有關(guān)，故抑制細(xì)胞增殖有助于減緩腎纖維化的進(jìn)展。本實驗通過復(fù)制慢性環(huán)孢素A腎病模型，探討柴苓湯是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖這一途徑減輕環(huán)孢素A慢性腎損傷。

1 材料與方法

1.1 藥物及試劑 柴苓湯，顆粒型，3g/袋(每1 g制劑相當(dāng)生藥量0.67 g)，購自日本TSMURA株式會社。制備工藝:柴胡7 g、黃芩3 g、半夏5 g、人參3 g、甘草2 g、生姜1 g、大棗3 g、豬苓 3 g、桂枝3 g、白術(shù)3 g、茯苓3 g、澤瀉5 g，上述藥味共煎后提取6 g，加入賦形劑至9 g。實驗時用蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為0.3 g/mL的溶液。纈沙坦由北京諾華制藥有限公司提供，批號800994。環(huán)孢素軟膠囊由華北制藥集團(tuán)新藥研究發(fā)展有限責(zé)任公司提供，批號090401，用橄欖油將其配制成質(zhì)量濃度為15 mg/mL的溶液，備用。免疫組化試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供。RT-PCR試劑盒由美國Invitrogen公司提供。Western Blot PCNA、FN抗體由美國LABVISION公司提供。流式細(xì)胞術(shù)PCNA抗體采用武漢博士德生物有限公司產(chǎn)品。

1.2 實驗動物及分組 40只雌性清潔級SD大鼠，8周，體質(zhì)量(200±10)g，河北醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，許可證號scxk(冀)2008-1-003。隨機(jī)分為對照組、模型組(環(huán)孢素A)、柴苓湯組、纈沙坦組，每組10只。

1.3 造模及藥物治療 實驗動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，環(huán)孢素A按30 mg/(kg·d)劑量灌服，每日1次，連續(xù)28 d，建立慢性環(huán)孢素A腎病大鼠模型；對照組每日灌胃給與等容量橄欖油。造模的同時，兩治療組分別給予柴苓湯［3 g/(kg·d)］和纈沙坦［10 mg/(kg·d)］治療，模型組和對照組每日給予等容量生理鹽水，實驗第29天，切取大鼠腎臟組織備檢。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 病理組織學(xué)檢查 HE、Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟病理組織學(xué)改變，并參照Katafuchi［2］評分標(biāo)準(zhǔn)從間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤、間質(zhì)纖維化、腎小管萎縮三方面對腎小管間質(zhì)損傷程度進(jìn)行半定量分析，每項參數(shù)積分值為0～3分，總計0～9分。具體評定標(biāo)準(zhǔn):無明顯病變，0分；病變＜25%，1分；病變25% ～50%，2分；病變 ＞50%，3分。

1.4.2 免疫組化檢測PCNA、FN陽性細(xì)胞表達(dá) 采用免疫組化SABC法，以光鏡下腎臟組織出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性表達(dá)。PCNA陽性細(xì)胞計數(shù):在每個腎臟皮質(zhì)切片中，觀察10個連續(xù)不同的200倍視野，以每個視野平均陽性細(xì)胞數(shù)作為比較指標(biāo)。

1.4.3 Western Blot檢測PCNA、FN蛋白表達(dá) 腎組織勻漿，提取蛋白后電泳，轉(zhuǎn)膜。2%牛奶封閉，加入一抗稀釋液(1∶500)，4℃過夜，PBS-Tween洗膜3次，再加入HRP標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶5000)，孵育1 h，PBS-Tween充分洗膜后，顯影，用富士LAS-4000 LIMINESCENT圖像分析儀拍照。

1.4.4 RT-PCR檢測PCNA、FN mRNA表達(dá) PCNA上游引物5'-CAG CAA GAC CTC GCT CCC CT-3'，下游引物5'-TCC CAT TGC CAA GCT CCC CA-3'，擴(kuò)增片段長度為593 bp；FN上游引物5'-CAC CTC GAG CCC GGA TAG CA-3'，下游引物5'-TCT CTC TCC TGG CCG TCC CT-3'，擴(kuò)增片段長度為433 bp；β-actin 上游引物5'-CAC GGT GTC ACC CAG ACC CG-3'，下游引物5'-AGC AGA GGC AGT GGC AGA CT-3'，擴(kuò)增片段長度為273 bp。產(chǎn)物電泳后，紫外燈下拍照，用BIO-PROFIF凝膠圖象分析系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.4.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 制作單細(xì)胞懸液，加入兔抗鼠PCNA抗體，室溫孵育后加入PBS洗滌，棄上清，加羊抗鼠FITC-IgG二抗，避光室溫孵育，加入PBS離心，棄上清(以除去未結(jié)合的熒光二抗)，過濾后上機(jī)檢測。采用美國BD公司FACS 420型流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，用DNA細(xì)胞周期分析軟件，計算出DNA組方圖各時相分布的百分比，并根據(jù)公式:(PI)=(S+G2M)/(G0/G1+S+G2M)×100%計算出增殖指數(shù)(PI)。

2 結(jié)果

2.1 腎臟病理 HE染色顯示:對照組未見明顯異常；模型組腎間質(zhì)大量炎性細(xì)胞浸潤，腎小管上皮細(xì)胞壞死、脫落，腎小管萎縮；柴苓湯組及纈沙坦組病變程度明顯輕于模型組。Masson染色顯示:對照組腎間質(zhì)可見少量膠原成分。模型組腎間質(zhì)膠原成分大量沉積，并呈條帶狀分布；柴苓湯及纈沙坦組腎間質(zhì)膠原成分較模型組明顯減少。半定量分析結(jié)果表明，模型組腎小管間質(zhì)損傷各項參數(shù)積分值均明顯高于對照組(P＜0.01)，與之相比，兩治療組各項積分值則明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠腎間質(zhì)損傷半定量評分 (，n=10)

表1 各組大鼠腎間質(zhì)損傷半定量評分 (，n=10)

注:與對照組相比，＊＊P＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別 炎細(xì)胞浸潤積分 間質(zhì)纖維化積分 腎小管萎縮積分 總積分對照組0.20±0.42 0.40±0.52 0.10±0.32 0.70±0.48模型組 2.60±0.52＊＊ 2.50±0.71＊＊ 2.50±0.53＊＊ 7.60±1.17＊＊柴苓湯組 1.50±0.53△△ 1.80±0.63△ 1.30±0.48△△ 4.60±1.07△△纈沙坦組 1.20±0.42△△ 1.70±0.48△△ 1.70±0.67△△ 4.60±0.97△△

2.2 免疫組化 PCNA表達(dá)情況:對照組腎小球和腎小管僅見少量PCNA陽性細(xì)胞。模型組陽性細(xì)胞較對照組明顯增多(P＜0.01)。柴苓湯及纈沙坦組PCNA陽性細(xì)胞較模型組顯著減少(P＜0.01)，但兩治療相比無明顯差異。見圖1，表2。FN表達(dá)情況:對照組FN僅在腎小管上皮細(xì)胞少量表達(dá)；模型組呈強(qiáng)陽性表達(dá)，染色明顯加深；經(jīng)柴苓湯及纈沙坦治療后，腎小管FN表達(dá)明顯減少。見圖2。

圖1 免疫組化檢測大鼠腎臟PCNA陽性細(xì)胞表達(dá) (×200)

2.3 Western Blot 對照組腎組織PCNA、FN蛋白僅少量表達(dá)，與之相比，模型組表達(dá)增強(qiáng)，柴苓湯組及纈沙坦組較模型組顯著減弱。見圖3。

2.4 RT-PCR 與對照組相比，模型組PCNA、FN mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)(P＜0.01)。柴苓湯及纈沙坦可下調(diào)這種高表達(dá)(P＜0.05，P＜0.01)，兩治療組基因表達(dá)無明顯差異。見圖 4，表 3。

表2 免疫組化檢測大鼠腎臟PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目(，n=10)

表2 免疫組化檢測大鼠腎臟PCNA陽性細(xì)胞數(shù)目(，n=10)

注:與對照組相比，＊＊P＜0.01；與模型組相比，△△P＜0.01。

組別 PCNA 陽性細(xì)胞數(shù)對照組3.90±2.38模型組 37.30±5.38＊＊柴苓湯組 21.00±3.83△△纈沙坦組 19.90±3.96△△

圖2 免疫組化檢測大鼠腎臟FN陽性細(xì)胞表達(dá) (×200)

2.5 流式細(xì)胞術(shù) 模型組處于S期的細(xì)胞比例較對照組增多(P＜0.01)，而處于G0/G1期的細(xì)胞比例較對照組減少(P＜0.01)；柴苓湯及纈沙坦組處于S期的細(xì)胞比例較模型組明顯降低(P＜0.01)，處于G0/G1期的細(xì)胞比例較模型組增多(P＜0.01)。各組G2/M期細(xì)胞比例相對接近，組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異。模型組PI較對照組明顯提高，與模型組比較，柴苓湯組及纈沙坦組PI顯著下降(P＜0.01)，但后兩組比較無顯著差異(P＞0.05))。見表4。

圖3 Western Blot檢測大鼠腎臟PCNA、FN蛋白表達(dá)

圖4 RT-PCR檢測大鼠腎臟PCNA、FN mRNA表達(dá)

表3 RT-PCR檢測大鼠腎臟PCNA、FN mRNA表達(dá) (，n=10)

表3 RT-PCR檢測大鼠腎臟PCNA、FN mRNA表達(dá) (，n=10)

注:與對照組相比，＊＊P ＜0.01；與模型組相比，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組別PCNA/18S FN/18S對照組0.71±0.06 0.89±0.03模型組 1.21±0.11＊＊ 1.21±0.02＊＊柴苓湯組 0.90±0.19△ 0.91±0.03△△纈沙坦組 0.98±0.04△ 1.02±0.04△△

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是慢性環(huán)孢素A腎病的主要病理特征，而細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)沉積是腎間質(zhì)纖維化的重要病理基礎(chǔ)。ECM合成降解失衡以致大量蓄積與細(xì)胞增殖有關(guān)。研究表明，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖，則ECM分泌增多，而抑制細(xì)胞增殖，則可使ECM蓄積減少［3］。環(huán)孢素A激活RAS后，RAS的主要活性物質(zhì)血管緊張素II(AngⅡ)大量分泌，并通過與其I型受體(AT1受體)結(jié)合誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞、系膜細(xì)胞增殖，進(jìn)而引起膠原蛋白、FN等ECM成分合成增加，降解減少，最終導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化。因此，細(xì)胞增殖在腎纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［4-6］。

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠腎臟細(xì)胞周期的情況(，n=3)

表4 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠腎臟細(xì)胞周期的情況(，n=3)

注:與對照組相比，＊＊P＜0.01；與模型組相比，△△P＜0.01。

級別 S期/% (G0/G1)/% (G2/M)/%PI/%對照組7.67±2.25 84.57±1.91 7.80±1.49 16.37±2.04模型組 30.10±2.50＊＊ 60.67±2.14＊＊ 9.21±1.15 39.32±2.15＊＊柴苓湯組 19.93±3.16△△ 72.30±4.16△△ 7.80±1.35 27.72±4.19△△纈沙坦組 17.83±0.59△△ 74.69±1.31△△ 7.94±0.71 25.66±0.07△△

PCNA是一種與細(xì)胞增殖密切相關(guān)的核內(nèi)蛋白，伴隨增殖活動而表達(dá)，因此被認(rèn)為是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物，用于評價細(xì)胞的增殖狀態(tài)［7-8］。動物實驗表明，正常成年大、小鼠腎臟的各部分增殖活動并不十分活躍，PCNA在腎小管和腎小球僅有少量表達(dá)［9］。當(dāng)腎臟受到損傷時，PCNA表達(dá)會顯著增加［10］。PCNA適量增加是對損傷組織的修復(fù)，但過度增加促進(jìn)了臟器硬化的進(jìn)展。PCNA是細(xì)胞周期依賴性蛋白，在細(xì)胞周期的各個階段合成、表達(dá)不同:G1期表達(dá)很少，S期達(dá)到高峰，G2和M期明顯下降［11］。其中G1-S是整個細(xì)胞周期的關(guān)鍵點，能夠?qū)?fù)雜的細(xì)胞內(nèi)外信號進(jìn)行整合與傳遞，保證細(xì)胞周期的正常進(jìn)行［12］。FN屬于一種非膠原性糖蛋白，與細(xì)胞增殖、分化、黏附等活動關(guān)系密切。作為ECM的主要成分，其表達(dá)水平在一定程度上可以反應(yīng)ECM的積聚程度，在大多數(shù)腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化病變中都可觀察到它的過度分泌。因此，F(xiàn)N可作為檢測腎纖維化的主要指標(biāo)之一。本研究從蛋白、基因多角度地檢測到PCNA與FN在慢性環(huán)孢素A腎病大鼠腎臟組織中呈高表達(dá)狀態(tài)。因此，抑制PCNA、FN的過度表達(dá)，對于減輕ECM增生性損傷意義重大。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果表明，與對照組相比，模型組大鼠處于S期的細(xì)胞比例增多，增殖指數(shù)明顯提高。這提示，環(huán)孢素A具有促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂，誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞增殖的作用。

本實驗同時觀察到，柴苓湯與血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑纈沙坦療效相近，均可明顯減輕環(huán)孢素A誘導(dǎo)的腎組織病理損害，并下調(diào) PCNA、FN的高表達(dá)，阻止細(xì)胞由G0/G1期進(jìn)入S期，降低細(xì)胞增殖活性。柴苓湯由五苓散和小柴胡湯相合而成:五苓散通陽化氣、健脾利水，小柴胡湯和暢氣機(jī)、疏利三焦，二方相合，有疏肝健脾利水之效。研究表明該方可抑制系膜增生性腎小球腎炎大鼠尿蛋白排泄及炎癥細(xì)胞浸潤［13］，并可明顯減少腎組織α-SMA的表達(dá)，有效抑制腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化［14］。本實驗結(jié)果顯示，柴苓湯可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期抑制環(huán)孢素A誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，從而延緩腎臟纖維化進(jìn)程。

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