痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛大鼠下丘腦、腦干NOS和5-HT表達的影響

楊德功， 付秋菊， 黃厚才， 鐘榮玲， 朱婉華， 田耀洲

（1.江蘇省中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028；2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210046；3.南通良春風濕病醫院，江蘇 南通 226009）

痛寧膠囊是南通良春風濕病醫院用于治療偏頭痛的院內制劑，其組方為孟河醫派傳人、國醫大師朱良春教授經驗名方，早在50年代即臨床應用，療效顯著，隨后于1963年發表于《中醫雜志》，但其治療偏頭痛的機制仍不清楚，為此我們通過復制硝酸甘油型偏頭痛動物模型，觀察了痛寧膠囊對偏頭痛大鼠下丘腦、腦干NOS及5－HT表達的影響，探討痛寧膠囊治療偏頭痛的作用機制，為臨床應用痛寧膠囊提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物與分組 SD大鼠48只，上海西普爾－必凱實驗動物有限公司，許可證號:SCXK(滬)2008－0016，雌雄各半，體質量(283±23)g，隨機分為空白對照組、模型組、陽性藥物組、痛寧膠囊高、中、低劑量組，每組8只。

1.1.2 主要藥物與試劑 痛寧膠囊，南通良春風濕病醫院院內制劑，批準文號:蘇藥制字 Z04 001376；產品批號: 091208；硝酸甘油注射液，每1 mL含硝酸甘油5 mg，由北京益民藥業有限公司生產，批準文號:國藥準字H11020289，生產批號:20 100911；琥珀酸舒馬普坦片，由天津華津制藥有限公司生產，批準文號:國藥準字 H20040700，生產批號:006909T，用蒸餾水配制成質量濃度為1 mg/mL的藥液備用；兔抗 5－羥色胺抗體(Anti－5－HT)，貨號 bs－1126R；兔抗一氧化氮合成酶－1 抗體(神經型)(Anti－NOS－1)，貨號 bs－0156R，均購自北京博奧森生物技術有限公司；SABC免疫組化檢測試劑盒，購自福建邁新生物技術開發公司；DAB購自美國Sigma公司；PBS緩沖液:南京醫科大學實驗室配制，每升中 含 8 g NaCl，0.2 g KCl，1.44 g Na2HPO4，0.24 g KH2PO4，pH調至7.4；其它試劑均為進口分裝或國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 偏頭痛模型建立及藥物干預 根據Tassorelli C等［1］報道的方法，除空白對照組不作處理，其余各組動物予以大鼠皮下注射硝酸甘油10 mL/kg，制作偏頭痛模型；30 min后按組灌胃給藥。空白對照組和模型對照組灌胃等容積的蒸餾水，陽性藥物對照組灌胃琥珀酸舒馬普坦藥液6 mL/kg，痛寧膠囊藥液高、中、低劑量組分別以 8.64、4.32、2.16 g/kg藥液灌胃。

1.2.2 灌注、取材、切片 造模后4 h，立即用10%水合氯醛300 mg/kg腹腔麻醉動物，仰臥固定，開胸，主動脈插管，剪開右心耳。首先迅速灌注無菌生理鹽水200 mL，然后灌注4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液150 mL，灌注后取大鼠腦組織，在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中再固定24 h，常規脫水，石蠟包埋。制備下丘腦、腦干石蠟切片。

1.2.3 免疫組化SABC法 石蠟切片常規脫蠟至水；PBS洗2遍，每遍5 min；切片浸入3%H2O2水溶液中，室溫封閉10 min，以去除內源性過氧化物酶；PBS洗3遍，每遍5 min；抗原微波修復20 min；PBS洗2遍，每遍5 min；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體；滴加一抗，4℃過夜；PBS洗2遍，每遍5 min；滴加生物素化二抗，37℃孵育30 min；PBS洗2遍，每遍5 min；滴加試劑SABC，37℃孵育20 min；PBS洗3遍，每遍5 min；滴加0.05%DAB+0.01%H2O2，顯色5～15 min；顯微鏡下隨時觀察顯色反應，至陽性顯色較強而背景不顯色時，自來水洗，終止顯色反應；蘇木素襯染、透明，中性樹膠封片。

1.2.4 圖片分析 光鏡下細胞核呈棕黃色染色者為陽性細胞。用顯微鏡照相系統和數碼成像系統進行拍攝200倍圖片，用Image ProPlus5.0.2圖像分析軟件測定各組每張切片上陽性細胞的平均面積。

2 結果

大鼠下丘腦、腦干經免疫組化SABC法染色后，光鏡下背景為淡黃色，NOS、5－HT陽性細胞均呈棕黃色或棕褐色，多散在分布(見圖1～16中紅色箭頭所示)。經數碼成像系統和圖像分析軟件，得如下結果。

2.1 各組大鼠下丘腦、腦干NOS陽性細胞平均面積的比較 下丘腦:與空白對照組比較，模型對照組NOS陽性細胞平均面積顯著增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、痛寧膠囊高劑量組、中劑量組NOS陽性細胞平均面積均有不同程度減少，差異具有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，而低劑量差異無統計學意義。高、中劑量組分別與陽性藥物對照組比較，統計學無顯著性差異(P＞0.05)。腦干:與空白對照組比較，模型對照組NOS陽性細胞平均面積明顯增加，差異具有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、高劑量組NOS陽性細胞平均面積均有不同程度減少，差異具有統計學意義(P＜0.05)，而中、低劑量組差異均無統計學意義。高劑量組與陽性藥物對照組均能明顯減少NOS陽性細胞平均面積，二者比較統計學無顯著性差異(P＞0.05)。見表1，圖1～8。

表1 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中NOS表達陽性細胞平均面積的影響()

表1 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中NOS表達陽性細胞平均面積的影響()

注:與空白對照組比較，*P＜0.05；＊＊P＜0.01；與模型對照組比較，△P＜0.05；△△P＜0.01；與陽性藥物對照組比較，▲P＞0.05。下同。

組別 動物/只劑量/(g·kg － 1)NOS平均面積/μm 2下丘腦 腦干空白對照 8 —221.35±67.68 243.10±53.81模型對照 8 — 317.52±60.34＊＊ 354.29±80.96＊＊琥珀酸舒馬普坦 8 0.006 236.67±34.05△△ 275.05±52.06△痛寧膠囊 8 8.64 232.06±34.44△△▲ 257.52±72.73△▲痛寧膠囊 8 4.32 249.39±43.06△▲ 264.997±88.60痛寧膠囊8 2.16 288.13±66.25 297.64±91.96

圖1 偏頭痛動物模型空白組下丘腦NOS陽性細胞 (×200)

圖2 偏頭痛動物模型模型組下丘腦NOS陽性細胞 (×200)

圖3 偏頭痛動物模型陽性藥物組下丘腦NOS陽性細胞 (×200)

圖4 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組下丘腦NOS陽性細胞(×200)

圖5 偏頭痛動物模型空白組腦干NOS陽性細胞 (×200)

圖6 偏頭痛動物模型模型組腦干NOS陽性細胞 (×200)

圖7 偏頭痛動物模型陽性藥物組腦干NOS陽性細胞(×200)

圖8 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組腦干NOS陽性細胞(×200)

2.2 各組大鼠下丘腦、腦干5－HT陽性細胞平均面積的比較下丘腦:與空白對照組比較，模型對照組5－HT陽性細胞平均面積顯著減少，差異具有統計學意義(P＜0.01)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、高、中劑量組5－HT陽性細胞平均面積均有不同程度增加，差異具有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，而低劑量組差異無統計學意義。高劑量組、中劑量組分別與陽性藥物對照組比較，統計學無顯著性差異(P＞0.05)。腦干:與空白對照組比較，模型對照組5－HT陽性細胞平均面積顯著減少，差異具有統計學意義(P＜0.05)。與模型對照組比較，陽性藥物對照組、高劑量組5－HT陽性細胞平均面積均有不同程度增加，差異具有統計學意義(P＜0.05)，而中、低劑量組差異均無統計學意義。高劑量組與陽性藥物對照組均能顯著增加5－HT陽性細胞平均面積，二者比較統計學無顯著性差異(P＞0.05)。見表2，圖9～16。

表2 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-HT表達陽性細胞平均面積的影響 ()

表2 痛寧膠囊對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠腦組織中5-HT表達陽性細胞平均面積的影響 ()

組別 動物/只劑量/(g·kg － 1)5－HT 平均面積/μm 2下丘腦 腦干空白對照 8 —442.62±90.87 378.31±99.00模型對照 8 — 221.24±50.42＊＊ 262.32±59.61*琥珀酸舒馬普坦 8 0.006 343.55±56.54△△ 322.31±30.31△痛寧膠囊 8 8.64 381.24±36.15△△▲ 324.16±49.26△▲痛寧膠囊 8 4.32 312.03±85.65△▲ 299.83±54.91痛寧膠囊8 2.16 252.17±53.35 243.88±45.65

圖10 偏頭痛動物模型模型組下丘腦5-HT陽性細胞(×200)

圖11 偏頭痛動物模型陽性藥物組下丘腦5-HT陽性細胞 (×200)

圖12 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組下丘腦5-HT陽性細胞 (×200)

圖13 偏頭痛動物模型空白組腦干5-HT陽性細胞 (×200)

圖14 偏頭痛動物模型模型組腦干5-HT陽性細胞 (×200)

圖15 偏頭痛動物模型陽性藥物組腦干5-HT陽性細胞 (×200)

圖16 偏頭痛動物模型痛寧膠囊高劑量組腦干5-HT陽性細胞(×200)

3 討論

許多實驗和臨床研究表明，NO在偏頭痛和其他血管性頭痛的產生機制中起著十分關鍵的作用［2］。其可通過擴張血管，引發神經源性炎癥，激活傷害感覺神經元的敏感性，介導機體內痛覺信號的傳導，從而放大其生物學作用，致使痛覺的發生［3］。而NOS是合成NO的關鍵酶，可催化左旋精氨酸(L－Arg)生成瓜氨酸的同時釋放出內源性NO，前者NOS活性的增高與痛敏狀態的維持有密切關系［4］，且NOS陽性神經元可能通過單突觸或多突觸連接引起自主神經核運動核激活，參與偏頭痛的伴發癥狀如惡心、嘔吐等［5］。而后者可能協同其它神經遞質在疼痛刺激的中樞傳遞中起重要作用，不但可以激發偏頭痛，而且能夠維持偏頭痛狀態［6］。

實驗中，予以皮下注射硝酸甘油后，大鼠下丘腦、腦干部位NOS表達增強，說明硝酸甘油能夠誘發NOS表達，NO合成增加，而進一步參與組織的發生免疫應答和炎癥反應，而予以痛寧膠囊干預后能夠顯著降低其表達，表明痛寧膠囊能夠阻止由硝酸甘油誘發的NOS的反應，減少內源性NO的生成。

研究發現，下丘腦中含有多種 5－HT 的受體的亞型［7－8］，而不同類型5－HT受體在痛覺生理和病理生理中有不同的作用，在偏頭痛的發病機制中更是復雜。5－HT2A受體激動能夠引起NO的生成增加，從而引起顱腦血管的擴張，致敏血管周圍疼痛感受器和三叉神經血管系統中樞傷害性感受神經元，觸發頭痛［9］。5－HT1B/1D受體激動劑，如舒馬普坦、佐米曲坦等能夠選擇性作用于血管平滑肌，使擴張的顱內動脈(主要是硬腦膜動脈)收縮，通過減少血管活性肽如降鈣素基因相關肽(CGRP)在血管周圍間隙的釋放，能減輕神經源性炎癥，且對腦干及上部頸髓的三叉神經尾側核的傷害性痛覺傳遞有抑制作用，還能調整一氧化氮信號轉導通路以及鈉離子依賴性細胞代謝活動［10］。形態學研究證明5－HT1FmRNA在三叉神經節有較高分布，選擇性的 5－HT1F受體激動劑lasmiditan可抑制電刺激三叉神經節誘導的硬腦膜血漿蛋白的外滲及三叉神經尾側c－fos的表達［11］，并且能夠有效治療偏頭痛的急性發作［12］，提示對于偏頭痛急性發作，5－HT1F受體的激動是一種可能的新的治療原則［13］。

本實驗發現，硝酸甘油誘導的偏頭痛大鼠腦干、下丘腦5－HT表達水平下降，而予以痛寧膠囊進行干預后，5－HT的表達水平上調，這可能是痛寧膠囊激動下丘腦部位5－HT受體亞型，使得傷害性痛覺上行傳導抑制；并且刺激腦干的5－HT能神經元，激活5－HT疼痛下行調控系統。

綜上所述，痛寧膠囊能夠通過降低NOS的表達、上調5－HT的水平，從而調整與疼痛相關的血管活性物質及神經遞質的水平，改善血管舒縮功能障礙，這可能是其治療偏頭痛的作用機制之一。

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