蘆筍水解氨基酸的測定

姜云云， 葉光明*， 范國榮， 陳云紅， 潘小明， 沐 韋

（1.中國人民解放軍第101醫(yī)院，江蘇 無錫 214044；2.第二軍醫(yī)大學(xué)藥物分析教研室，上海 200433）

蘆筍Asparagus officinalis L.為百合科天門冬屬植物，學(xué)名石刁柏，又名蘆荀、龍須菜、細(xì)百葉部等。現(xiàn)代研究表明蘆筍具有抗腫瘤、抗真菌、抗病毒、降血脂等活性，是理想的綠色保健食品［1-3］。蘆筍中含有豐富的多糖、黃酮、氨基酸等活性成分，是蘆筍發(fā)揮藥理藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)。

目前對蘆筍氨基酸的研究已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，安玉會(huì)等［4］采用氨基酸自動(dòng)分析儀對蘆筍口服液中的氨基酸進(jìn)行了分析，所用儀器昂貴、測定成本較高，不適合推廣應(yīng)用；邵旭等［5］用柱前衍生HPLC法測定了蘆筍中的門冬氨酸，該方法采用了專門的氨基酸分析柱，且只測定了一種氨基酸，不能系統(tǒng)評價(jià)蘆筍中氨基酸的分布。本實(shí)驗(yàn)采用柱前衍生化法測定蘆筍中的11種氨基酸，所用方法簡單易行、測定結(jié)果準(zhǔn)確，且無需特殊設(shè)備，該法可用于蘆筍氨基酸成分的質(zhì)量控制。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 島津LC-10A系列高效液相色譜儀，包括 LC-10ATvp泵，SCL-10Avp系統(tǒng)控制器，SIL-10ADvp自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-10ASvp柱溫箱，SPD-10vp紫外檢測器，工作站為島津 CLASS-VP。SK7200H超聲儀(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)，HA-202M 電子天平(A＆D Company LTD.)。

1.2 試藥 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品(BDH Chemical LTD，Poole England)，衍生化試劑6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺基氨基甲酸酯 (AQC)及緩沖液(Waters公司)，乙腈為色譜純(克萊頓，加拿大)，磷酸和三乙胺為分析純(上海化學(xué)試劑有限公司)，水為自制去離子水(18.2 MΩ)。蘆筍鮮品購于當(dāng)?shù)爻校a(chǎn)地福建，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院生藥教研室張巧艷教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液配制 分別稱取組氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、胱氨酸、酪氨酸、纈氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸適量，用0.1 mol/L鹽酸配成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。該貯備液再用水稀釋成含上述各氨基酸均為20 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)對照溶液，即得。

2.2 供試品溶液的配制 稱取新鮮蘆筍勻漿液0.8 g置5 mL量瓶中，加入6 mol/L鹽酸溶液至刻度，混勻，將該混懸液移至安瓿瓶中，用氮?dú)鈱碴称恐械目諝廒s凈，封口，于110℃放置24 h水解，取水解液 1 mL于 10 mL量瓶中，加入1.2 mol/L NaOH溶液5 mL，混勻，并用水定容至刻度，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3 氨基酸衍生化反應(yīng)［6］精密吸取對照品溶液或供試品溶液50 μL于0.5 mL離心管中，加入350 μL緩沖液，渦旋10 s，再加入100 μL衍生化試劑，渦旋10 s，于55℃烘箱中放置10 min，取出冷至室溫，于4℃冰箱保存待測。

2.4 色譜條件 Diamonsil?(鉆石)C18柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)(Dikma Technologies)；采用梯度洗脫，流動(dòng)相 A為磷酸-三乙胺-水(0.3∶0.5∶100)，流動(dòng)相B為乙腈-水(60∶40)，洗脫程序見表1；檢測波長248 nm；柱溫37℃；進(jìn)樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min。

表1 流動(dòng)相梯度程序Tab.1 Gradient elution program of mobile phase

2.5 專屬性試驗(yàn) 以水代替蘆筍勻漿液按2.2項(xiàng)下制備空白樣品液，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行衍生化反應(yīng)，在上述色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。空白樣品液對待測氨基酸的分離沒有干擾，方法專屬性良好。

2.6 線性考察 配制系列質(zhì)量濃度的混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別衍生化反應(yīng)后進(jìn)高效液相色譜儀檢測，記錄各氨基酸衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積，與各自質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.7 精密度試驗(yàn) 取對照品溶液，衍生化反應(yīng)后連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄各氨基酸衍生化產(chǎn)物的色譜峰面積值，結(jié)果各氨基酸的RSD值均小于1.5%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批蘆筍樣品，按2.2項(xiàng)下平行制備5份樣品溶液，衍生化反應(yīng)后分別進(jìn)高效液相色譜儀檢測，記錄各氨基酸衍生化產(chǎn)物色譜峰面積值并計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果各氨基酸的RSD值均小于3.0%。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取蘆筍勻漿液，按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，衍生化反應(yīng)后分別于 0、1、2、4、6、8 h檢測，記錄各氨基酸衍生化產(chǎn)物色譜峰面積值，結(jié)果各氨基酸的RSD值均小于1.5%，表明樣品在衍生化反應(yīng)后8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)。取6份已知氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的蘆筍勻漿液，各加入對照品溶液適量，按2.2項(xiàng)下處理并進(jìn)行衍生化反應(yīng)，進(jìn)高效液相色譜儀檢測，計(jì)算回收率，結(jié)果見表3。

2.11 樣品測定 取10批蘆筍樣品，按2.2項(xiàng)下配制供試品溶液，測定其中11種氨基酸，結(jié)果如下:組氨酸2.97‰ ～5.56‰，甘氨酸0.39‰ ～0.53‰，天冬氨酸1.64‰ ～3.63‰，谷氨酸0.89～1.55‰，蘇氨酸0.32‰ ～0.46‰，丙氨酸0.32‰ ～0.57‰，胱氨酸0.47‰ ～1.01‰，酪氨酸0.23‰ ～0.28‰，纈氨酸0.36‰ ～0.65‰，亮氨酸0.37‰ ～0.60‰，苯丙氨酸0.35‰～0.44‰。

圖1 蘆筍氨基酸的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of amino acids in Asparagus officinalis L

表2 11種氨基酸的線性考察Tab.2 Linearity test of 11 amino acids

表3 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery test

3 討論

氨基酸是廣泛存在于植物體內(nèi)的一種含氮物質(zhì)，是構(gòu)成生物體蛋白質(zhì)分子的基本單位，也是蛋白質(zhì)消化后的最終產(chǎn)物，在生物體內(nèi)具有特殊的生理功能，對人體疾病治療和保健具有重要價(jià)值。蘆筍中的氨基酸成分比較豐富，品種齊全，富含必需氨基酸和藥效氨基酸，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和保健作用［7］。

氨基酸的測定方法較多，其中，氨基酸分析儀雖然操作簡便，但價(jià)格昂貴，使用成本高，不適合普及［8-10］。柱前衍生化法目前應(yīng)用較為廣泛，衍生化試劑品種繁多［11-12］，本實(shí)驗(yàn)采用的HPLC-AccQ-Tag法是Waters公司專為柱前衍生高效液相分析氨基酸而開發(fā)的創(chuàng)新方法。其核心在于名為AQC的專利衍生劑能與所有含氨基的化合物發(fā)生快速、定量反應(yīng)，過量的AQC可在1 min內(nèi)水解為不干擾測定的AMQ，生成的衍生物穩(wěn)定。Waters公司為該法配備了專門的氨基酸分析柱和相應(yīng)的流動(dòng)相洗脫程序，但考慮到氨基酸分析柱價(jià)格昂貴，適用范圍窄等缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用普通的C18柱進(jìn)行分離，所用流動(dòng)相也作了相應(yīng)調(diào)整，結(jié)果也能獲得較為滿意的分離效果，使得該法具有更強(qiáng)的適用性。

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