復(fù)方鹿仙草片質(zhì)量控制方法的簡(jiǎn)化與提高研究

韓桂茹， 張 鵬， 安麗娜， 申玉龍

（1.河北省藥品檢驗(yàn)所，河北 石家莊 050011；2.承德燕峰藥業(yè)有限責(zé)任公司，河北 承德 067600）

復(fù)方鹿仙草片為地標(biāo)升國(guó)標(biāo)的品種復(fù)方鹿仙草顆粒［1］［標(biāo)準(zhǔn)號(hào):WS-10461(ZD-0461)-2002］的改劑型產(chǎn)品，原標(biāo)準(zhǔn)［2］收載了苦參、土茯苓、天花粉的薄層鑒別，氧化苦參堿的定量測(cè)定。不論薄層鑒別和定量測(cè)定，其樣品的前處理都比較麻煩，導(dǎo)致重復(fù)性比較差，最為關(guān)鍵的是只對(duì)氧化苦參堿進(jìn)行了測(cè)定，從目前的文獻(xiàn)［3］得知，苦參堿和氧化苦參堿都是有效成分，并存在互變異構(gòu)現(xiàn)象，在苦參藥材中幾乎都是以氧化苦參堿的形式存在，但在制劑中，因含還原性成分或受熱時(shí)間長(zhǎng)，都會(huì)使氧化苦參堿減少，苦參堿增多，所以只測(cè)定一種成分，無(wú)法有效控制產(chǎn)品質(zhì)量。為此，對(duì)復(fù)方鹿仙草片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)重新進(jìn)行了簡(jiǎn)化和提高研究，報(bào)道如下。

1 材料、儀器與試藥

1.1 材料 復(fù)方鹿仙草片(批號(hào):10945001、10945002、10945003)及處方中藥材由承德燕峰藥業(yè)股份有限公司提供；對(duì)照藥材:苦參(批號(hào):121019-200304)、土茯苓(批號(hào):121439-200401)、天花粉(批號(hào):121361-200401)，對(duì)照品:咖啡酸(批號(hào):110885-200102)苦參堿(批號(hào):110736-200934)、氧化苦參堿(批號(hào):110780-200506)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。九香蟲(chóng)和黃藥子由河北省醫(yī)院藥劑科陳太平主任藥師，分別鑒定為蝽科昆蟲(chóng)九香蟲(chóng)Aspongopus chinensis Dallas的干燥體和薯蕷科植物黃獨(dú)Dioscorea bulbifera L.的干燥塊莖。

1.2 儀器 日本島津液相色譜儀:配有LC-20AT泵；SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器；LC-solution色譜工作站；色譜柱:迪馬 dimonsil色譜柱(5 μm，4.6 mm ×150 mm)。

1.3 試劑、試藥 流動(dòng)相所用的乙腈、甲醇為色譜純，其它試劑、試藥均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 苦參的薄層鑒別 取本品10片，除去包衣，研細(xì)，稱(chēng)取2.0 g，加甲醇5 mL，超聲處理10 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取苦參對(duì)照藥材0.3 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為對(duì)照藥材溶液。再取苦參堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液各5 μL、供試品溶液10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨(10∶2∶2.5∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以碘化鉍鉀試液。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色斑點(diǎn)。經(jīng)空白驗(yàn)證，空白樣品(不含苦參的樣品)無(wú)干擾(見(jiàn)圖1)。

圖1 樣品中苦參TLC圖Fig.1 TLC chromatogram of Sophorae flavescenttis Radix in sample

2.1.2 鹿仙草與土茯苓的薄層鑒別 取土茯苓對(duì)照藥材0.5 g，加乙醇10 mL，回流提取15 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為土茯苓對(duì)照藥材溶液。另取鹿仙草對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為鹿仙草對(duì)照藥材溶液。再取咖啡酸對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。吸取對(duì)照品溶液3 ～5 μL、對(duì)照藥材溶液 8 ～10 μL、2.1.1 項(xiàng)下供試品溶液5～6μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(7∶3∶0.4)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視，供試品色譜中，在與對(duì)照品和鹿仙草對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色主斑點(diǎn)；再?lài)娨?%磷鉬酸無(wú)水乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，分別顯相同顏色主斑點(diǎn)。經(jīng)空白驗(yàn)證，空白樣品(不含鹿仙草或土茯苓的樣品)無(wú)干擾(見(jiàn)圖2-A，圖2-B)。

2.1.3 為九香蟲(chóng)的薄層鑒別 取九香蟲(chóng)對(duì)照藥材0.3 g，加甲醇3 mL，超聲處理10 min，上清液作為對(duì)照藥材溶液。吸取對(duì)照藥材溶液與2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨(4∶1∶4∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色熒光主斑點(diǎn)。經(jīng)空白驗(yàn)證，空白樣品(不含九香蟲(chóng)的樣品)無(wú)干擾(見(jiàn)圖3)。

圖2-A 樣品中咖啡酸和鹿仙草TLC圖 圖2-B 樣品中土茯苓、鹿仙草TLC圖Fig.2-A TLC chromatogram of caffeic acid and Balanophorae Herba in sampleFig.2-B TLC chromatogram of Smilacis glabrae Rhizoma and Balanophorae Herba in sample

圖3 樣品中九香蟲(chóng)TLC圖Fig.3 TLC chromatogram of Aspongopus in sample

2.1.4 為黃藥子的薄層鑒別 取黃藥子對(duì)照藥材0.5 g，加水 30 mL，煎煮 20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。吸取對(duì)照藥材溶液與2.1.1項(xiàng)下的供試品溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-濃氨(10∶2∶2.5∶0.5)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與黃藥子對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)。經(jīng)空白驗(yàn)證，空白樣品(不含黃藥子的樣品)無(wú)干擾(見(jiàn)圖4)。

2.1.5 為天花粉的薄層鑒別 取本品細(xì)粉0.3 g，加40%甲醇5 mL，超聲處理5 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取天花粉對(duì)照藥材0.3 g，加40%甲醇5 mL，超聲處理10 min，上清液作為對(duì)照藥材溶液。吸取對(duì)照藥材溶液和供試品溶液各3～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇-無(wú)水乙醇-冰醋酸-水(8∶2∶2∶3)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，熱風(fēng)吹干，噴以2%磷鉬酸無(wú)水乙醇溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。經(jīng)空白驗(yàn)證，空白樣品(不含天花粉的樣品)無(wú)干擾(見(jiàn)圖5)。

圖4 樣品中黃藥子TLC圖Fig.4 TLC chromatogram of Dioscoreae-Bulbifeerae Rhizoma in sample

圖5 樣品中天花粉TLC圖Fig.5 TLC chromatogram of Trichosanthis Radix in sample

2.2 苦參堿和氧化苦參堿測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相為乙腈-甲醇－0.1%磷酸 (1.5∶4∶94.5)；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫40℃；體積流量1.0 mL/min；理論板數(shù)按氧化苦參堿峰計(jì)算應(yīng)不低于2000。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱(chēng)取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成每1 mL含苦參堿和氧化苦參堿各15 μg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品10片，除去包衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)15 min，放冷，再稱(chēng)定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液3 mL，置中性氧化鋁柱(φ1 cm，100～120目中性氧化鋁2.5 g)上，用70%甲醇洗脫至10 mL量瓶中至約9 mL，加1滴磷酸，用70%的甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。即得。

2.2.4 樣品的測(cè)定 取供試品，按供試品制備及色譜條件項(xiàng)下，進(jìn)行提取，制備，進(jìn)樣10 μL，以外標(biāo)二點(diǎn)法計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 復(fù)方鹿仙草片中苦參堿和氧化苦參堿測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.1 Contents of matrine and oxymatrine in Compound Luxiancao Tablet(n=3)

2.2.5 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 采用日本島津液相色譜儀；LC-20AT泵；SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器；LC-solution色譜工作站，對(duì)苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品以及復(fù)方鹿仙草片中相應(yīng)色譜峰分別進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果表明:苦參堿和氧化苦參堿光譜圖相似，其最大吸收都在(205±2)nm附近，且對(duì)照品和供試品波峰基本一致，采用210 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2.6 線(xiàn)性范圍 取每1 mL含0.0435 mg和0.2175 mg的苦參堿對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣1、2、5、10 μL 和3、5 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明:苦參堿進(jìn)樣量在0.0435～1.0875 μg與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為:Y=1652490 X+3517，r=0.99997。再取每1 mL含0.0515 mg和0.3892 mg的氧化苦參堿對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣 1、2、5、10、15 μL 和 3 μL，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。結(jié)果表明:氧化苦參堿進(jìn)樣量在0.0515～1.946 μg與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為:Y=1445790X －1324，r=0.999999。

2.2.7 精密度實(shí)驗(yàn) 取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品與相應(yīng)的供試品溶液，各進(jìn)樣5次，每次10 μL，對(duì)照品5次測(cè)定的峰面積平均值，苦參堿為398810，RSD為 0.56%，氧化苦參堿為 364976，RSD為0.47%；供試品中苦參堿的平均值為317035，RSD為0.13%，氧化苦參堿的為292002，RSD為0.21%。說(shuō)明精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下的對(duì)照品溶液與供試品溶液，繼續(xù)每隔一定時(shí)間，向高效液相色譜儀注入一針，考察了24 h內(nèi)的穩(wěn)定性，其RSD:對(duì)照品苦參堿的為0.59%，氧化苦參堿的為0.58%；供試品中苦參堿的為0.36%，氧化苦參堿的為0.32%。說(shuō)明對(duì)照品與供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 以高(120%)、中(100%)、低劑量(80%)，取同一批樣品(批號(hào):10945001)9份，按供試品制備及色譜條件項(xiàng)下，制備樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定。同批樣品9次測(cè)定的結(jié)果，苦參堿平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.76 mg/g，RSD為1.40%；氧化苦參堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.80 mg/g，RSD為2.06%；二者之和的質(zhì)量分?jǐn)?shù)含量為3.56 mg/g，RSD為1.58%。說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.2.10 回收率試驗(yàn) 采用加樣回收試驗(yàn)。取已測(cè)定的同一批樣品9份(批號(hào):10945001)每份0.24 g，精密稱(chēng)定，按高、中、低劑量，加上相應(yīng)的對(duì)照品，按供試品測(cè)定項(xiàng)下，制備樣品溶液，進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率?？鄥A的平均回收率為99.09%(n=9)，RSD為1.39%(見(jiàn)表2)；氧化苦參堿的平均回收率為100.18%(n=9)，RSD為2.08%(見(jiàn)表3)。

2.2.11 定量測(cè)定專(zhuān)屬性試驗(yàn) 取苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品溶液、復(fù)方鹿仙草片供試品溶液與空白溶液(處方中不加苦參的樣品)，分別采用正文項(xiàng)下的測(cè)定條件，進(jìn)行HPLC色譜測(cè)定。樣品與苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品在同一保留時(shí)間有相同的波峰出現(xiàn)，而空白溶液則無(wú)相應(yīng)的峰，證明空白樣品不干擾測(cè)定，定量測(cè)定專(zhuān)屬(見(jiàn)圖6～8)。

3 討論

3.1 苦參主含苦參堿和氧化苦參堿，具抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、抗心率失常，鎮(zhèn)咳，殺菌等廣泛的生物活性。其定量測(cè)定，有薄層掃描法，毛細(xì)管電泳法，高效液相法等，最常用的是高效液相法。但存在三大弊端:第一，不論藥材［4-5］還是制劑［6-7］，前處理方法都比較繁瑣、復(fù)雜，需用三氯甲烷等毒害溶劑純化處理，費(fèi)時(shí)長(zhǎng)，成本高、效率低、污染環(huán)境，危害健康，并直接影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。第二，反相色譜的流動(dòng)相多是緩沖鹽中添加十二烷基硫酸鈉［8］或三乙胺［9］等，溶質(zhì)增多，比重增大，壓力增高，稍不注意就會(huì)損傷儀器和色譜柱，最為關(guān)鍵的是苦參堿或氧化苦參堿多不能用同一流動(dòng)相同時(shí)測(cè)定，即便有進(jìn)行同時(shí)測(cè)定［10］的二者的保留時(shí)間，相差在16 min以上，每測(cè)定一針需花費(fèi)50 min。第三，采用正相色譜［11-12］，必須是特定的氨基柱，其流動(dòng)相中的有機(jī)相要達(dá)90%以上，測(cè)定成本升高，柱壽命縮短。

表2 樣品中苦參堿的回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Results of recovery test for matrine in sample

表3 樣品中氧化苦參堿的回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery test for oxymatrine in sample

圖6 對(duì)照品HPLC色譜圖1.苦參堿2.氧化苦參堿Fig.6 HPLC chromatogram of reference substance 1.matrine 2.oxymatrine

圖7 復(fù)方鹿仙草片HPLC色譜圖1.苦參堿2.氧化苦參堿Fig.7 HPLC chromatogram of Compound Luxiancao Tablet 1.matrine 2.oxymatrine

圖8 空白樣品HPLC色譜圖Fig.8 HPLC chromatogram of negative sample

3.2 本研究采用含水甲醇提取樣品后，吸取一定量，氧化鋁柱除雜，含水甲醇洗脫，濾過(guò)，續(xù)濾液進(jìn)樣的程序，取代了原方法的氨試液堿化，三氯甲烷提取、中性氧化鋁柱除雜，三氯甲烷與三氯甲烷-甲醇(7∶3)洗脫，洗脫液蒸干，定容，濾過(guò)，濾液進(jìn)樣的程序。做到了樣品處理程序無(wú)濃縮、無(wú)蒸干、無(wú)萃取，簡(jiǎn)便、快捷、省時(shí)、省能源、有效提高了工作效率與方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。最為關(guān)鍵的是:采用普通的反相色譜柱，非緩沖鹽體系，進(jìn)行了復(fù)方鹿仙草片中苦參堿和氧化苦參堿的同時(shí)定量測(cè)定，生物堿波峰分離良好，色譜柱耐用性廣。

3.3 簡(jiǎn)化和提高后的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)現(xiàn)了處方中的味味藥材有鑒別，主藥中的兩種生物堿有定量測(cè)定，有效提高了質(zhì)量檢測(cè)內(nèi)容。而且完成六味藥材的鑒別，只需樣品2.3 g，薄層板5塊，提取溶劑35 mL，展開(kāi)劑50 mL，時(shí)間2 h；完成定量測(cè)定只需樣品0.8 g，前處理時(shí)間1.5 h，溶劑35 mL。與原標(biāo)準(zhǔn)相比，在增加3項(xiàng)薄層鑒別和一項(xiàng)定量測(cè)定指標(biāo)的情況下，還比原標(biāo)準(zhǔn)節(jié)約有機(jī)溶劑420 mL，時(shí)間12 h。該研究?jī)?nèi)容無(wú)疑是今后中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的發(fā)展方向。

3.4 本制劑還參照中國(guó)藥典2010年版一部苦參與文獻(xiàn)［12］項(xiàng)下的測(cè)定條件，采用waters氨基酸高效液相色譜柱，以乙腈-無(wú)水乙醇－3%磷酸(81∶9.5∶9.5)為流動(dòng)相，進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，流動(dòng)相平衡所需時(shí)間長(zhǎng)，在平衡過(guò)程中正負(fù)波動(dòng)幅度太大。測(cè)定時(shí)對(duì)照品有倒峰出現(xiàn)，苦參堿和氧化苦參堿對(duì)照品前端呈現(xiàn)了3個(gè)類(lèi)似于甲醇的溶劑峰，樣品溶液中的苦參堿峰與雜質(zhì)不能分離，且苦參堿的保留時(shí)間也與對(duì)照品不一致。流動(dòng)相條件比較苛刻，酸度稍有變化，即由3%變?yōu)?.9%，樣品溶液就無(wú)法分離。不僅如此，流動(dòng)相中有機(jī)相達(dá)90%以上，不但測(cè)定成本為本方法的16倍以上，而且測(cè)定結(jié)束后，色譜柱很難用甲醇沖洗干凈，降低了色譜柱的使用壽命。

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