調免毓麟湯對免疫性不育大鼠精液酸性磷酸酶、抗精子抗體及合籠后雌鼠妊娠率的影響

舒勁松，曹繼剛，周安方，黃瓊霞，董德河

（湖北中醫藥大學 基礎醫學院，湖北 武漢 430065）

免疫性不育的臨床診斷主要以血清或（和）精漿中發現抗精子抗體（AsAb）為依據，多伴有腰膝酸軟、耳鳴等癥狀或有生殖道感染、性腺損傷、輸精管堵塞等病史［1］。存在于正常人精漿中的精漿免疫抑制物（seminal plasma immunoinhibition material，SPIM）能遮蔽和改變精子抗原，抑制局部和全身的細胞、體液免疫反應，維護正常的生殖生理過程。有研究表明，人精液酸性磷酸酶（ACP）是人精液中的免疫抑制物的主要成分之一，其減少時可能會引起AsAb的產生。根據《實用男科疾病診斷治療學》［2］及《臨床疾病診斷依據治愈好轉標準》［3］制定的免疫性不育治療效果標準——AsAb轉陰是治療免疫性不育的一項重要指標。本實驗通過檢測大鼠精液ACP活性，觀察調免毓麟湯對模型大鼠的AsAb轉陰率以及與配對雌鼠合籠后的胚胎數和妊娠率等指標，探討調免毓磷湯抑制AsAb的產生及生殖系統免疫反應的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物

3月齡SD雄性大鼠120只，雌性70只，體重（280±20）g。購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心。

1.2 藥物

調免毓麟湯（熟地、巴戟天、蒲公英、敗醬草、丹參、川牛膝、甘草等組成），由湖北中醫藥大學附屬門診部制成水煎劑，臨用時用蒸餾水配成低、中、高三種不同的濃度，即1.04、2.08、4.16g／mL；醋酸強的松片，江西國藥廠生產，批號：0604041，臨用時研末用蒸餾水配成0.0324g／mL的混懸液。

1.3 試劑與儀器

酸性磷酸酶（ACP）試劑盒，由南京建成生物工程研究所提供。其組成為：緩沖液、基質液、堿液、顯色劑、酶標準貯備液，臨用時酶標準貯備液按1：10與蒸餾水配制成0.1 mg／mL的酶標準應用液。抗精子抗體酶聯免疫測定（ELISA）試劑盒，由華美生物工程公司提供。試劑盒內組分有：預包被板，樣品反應液，陰性對照液，陽性對照液，清洗液，酶結合物，顯色液A，顯色液B，終止液。

1.4 造模與給藥

參照張淑芹等［1］方法，將60只雄性大鼠采用同種異體抗原進行主動免疫，復制免疫性不育大鼠模型。第3次加強免疫后共有57只大鼠血清AsAb為陽性，2只大鼠血清AsAb為陰性，1只死亡。

大鼠造模前隨機取10只作為正常對照組，并將57只AsAb陽性雄性大鼠按隨機數字表法隨機分為模型組11只、醋酸強的松組11只、調免毓麟湯低劑量組11只、調免毓麟湯中劑量組12只、調免毓麟湯高劑量組12只。正常組及模型組灌胃生理鹽水，其余各組灌胃相應藥2mL／只，每日1次，連續30天。

1.5 取材與制備

各組雄鼠在灌胃給藥第30天，按照文獻［4］進行大鼠采精實驗。抗原的制備：每次免疫前取3月齡雄性SD大鼠12只，急性斷頭處死后取雙側附睪，用生理鹽水沖洗，置于10mLM199獲能液中，剪碎，37℃靜置15min，尼龍網（孔徑200μm）過濾，37℃培育1.5h，加PBS溶液調精子數為2.8×106／mL，加入完全福氏佐劑10mL，研磨混勻作為抗原。又分別于灌胃給藥第10天、第20天、第30天斷尾取血10μL，分離血清，用酶聯免疫吸附法（ELISA法）檢測血清AsAb；停藥后，各組雄鼠與雌鼠合籠1周，每只雄鼠與1只雌鼠配對，從合籠次日起每天上午9：00-10：30作陰道涂片。

1.6 統計學處理

2 實驗結果

2.1 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠精液ACP活性的影響

實驗結果表明，模型組大鼠精液ACP活性顯著下降，與正常組比較有極顯著性差異（P＜0.01）；各治療組大鼠精液ACP活性較之模型組有所上升，醋酸強的松組大鼠精液ACP活性與調免毓麟湯低劑量組比較差異不顯著（P＞0.05），與調免毓麟湯中、高劑量組比較有極顯著性差異（P＜0.01）；調免毓麟湯中、高劑量組間比較差異不顯著（P＞0.05）。見表1。

表1 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠精液ACP活性的影響（）

表1 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠精液ACP活性的影響（）

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與醋酸強的松組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與調免毓麟湯低劑量組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

組別 n ACP（U／mL）10 63.93±14.89模型組 11 39.09±8.96△△醋酸強的松組 11 48.90±10.05△△★調免毓麟湯低劑量組 11 48.16±10.36△△★調免毓麟湯中劑量組 12 56.07±10.48★★▲▲◇調免毓麟湯高劑量組 12 57.48±10.56正常組★★▲▲◇

2.2 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠血清AsAb的影響

實驗結果顯示，治療第10天，各治療組轉陰率比較差異不顯著（P＞0.05）；治療第20天，各治療組轉陰率比較差異不顯著（P＞0.05）；治療第30天，調免毓麟湯各劑量組與醋酸強的松組比較有顯著性差異（P＜0.05），調免毓麟湯各劑量組之間比較差異不顯著（P＞0.05）。見表2。

表2 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠血清AsAb的影響 ［n（%）］

2.3 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠合籠后雌鼠妊娠率的影響

實驗結果表明，模型組配對雌鼠有2只妊娠，其中有1只雌鼠在妊娠第11天流產；調免毓麟湯各劑量組妊娠率、每胎胚胎數均高于醋酸強的松組和模型組，調免毓麟湯各劑量組與模型組、醋酸強的松組比較有顯著性差異（P＜0.01）；醋酸強的松組與模型組比較差異不顯著（P＞0.05）。提示調免毓麟湯能顯著提高雌鼠妊娠率、每胎胚胎數。此外，還觀察到醋酸強的松組雄鼠毛欠光澤，不柔順，飲食減少，體重下降，可能是醋酸強的松的副作用所致。由此推測，醋酸強的松的副作用可能是影響雌鼠妊娠率、每胎胚胎數的原因之一。見表3。

表3 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠合籠后雌鼠妊娠率的影響（）

表3 調免毓麟湯對免疫性不育大鼠合籠后雌鼠妊娠率的影響（）

注：與正常組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與模型組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01；與醋酸強的松組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與調免毓麟湯低劑量組比較，◇P＜0.05，◇◇P＜0.01。

10 10 100.0 131 13.1±1.5模型組 11 2 18.2△△ 8 4.0±1.4△△醋酸強的松組 11 4 36.4△△ 18 4.6±2.3△△調免毓麟湯低劑量組 11 9 81.8★★▲▲ 108 12.0±2.0★★▲▲調免毓麟湯中劑量組 12 11 91.7★★▲▲ 129 11.7±3.4★★▲▲調免毓麟湯高劑量組 12 11 91.7★★▲▲ 133 12.1±1.7總胚胎數 每胎胚胎數正常組組別 n 妊娠雌鼠數 妊娠率（%）★★▲▲

3 討論

SPIM是存在于精液中的一組物質，通過封閉精子膜特異性抗原位點，或者通過對各種免疫細胞的抑制作用，使精子免受免疫細胞的進攻，從而保護精子，使得自身不產生免疫反應；ACP是人精液中的免疫抑制物的主要成分之一，其減少時可能會引起AsAb的產生。AsAb對精子膜固有成分及膜表面被覆成分的結合，不僅可以干擾精子的代謝及獲能過程，影響精子的存活，導致精子凝集，活力下降；而且表面帶有AsAb的精子，難以穿透宮頸粘液，從而降低受精部位的精子數；此外，AsAb還可干擾受精過程，甚至影響受精卵的分裂和植入以及胚胎的存活，導致流產和不育。本實驗中模型組配對雌鼠只有2只妊娠，其中1只雌鼠在妊娠第11天流產，說明AsAb可通過不同的環節和機制影響精子的功能，干擾受精過程，而致流產和不育。

由于腎上腺皮質激素既有抗炎作用，又可影響抗原的合成，抑制AsAb和補體介導的精子細胞毒性，因而被西醫用作治療男性免疫性不育的常用藥物，但長期或大劑量使用副作用大［5］。調免毓麟湯治療作用在于扶正祛邪，扶正是調整機體的免疫功能，祛邪則是排除破壞免疫平衡的因素，從而達到新的平衡，同時調節全身免疫系統來消除As-Ab，使免疫功能恢復正常，且未見副作用。本實驗中模型組大鼠精液ACP活性明顯下降，很可能是精液參數各項指標下降，誘導AsAb產生，導致不育的重要原因。醋酸強的松組大鼠出現的毛欠光澤、不柔順、飲食減少、體重下降等情況，可能是醋酸強的松的副作用所致。治療第30天，調免毓麟湯各劑量組AsAb轉陰率顯著高于醋酸強的松組；調免毓麟湯各劑量組妊娠率和每胎胚胎數均高于模型組和醋酸強的松組。由此可知，調免毓麟湯對免疫性不育的治療作用可能是通過提高精液ACP活性，從而抑制AsAb的產生，提高生育力。

［1］陳如鉤.不孕不育治療學［M］.上海：上海科學技術出版社，1997：144.

［2］郭瑞林.實用男科疾病診斷治療學［M］.北京：人民軍醫出版社，1994：74.

［3］孫傳興.臨床疾病診斷依據治愈好轉標準［M］.北京：人民軍醫出版社，1999：464

［4］鄭新民，李聚學，魏雁，等.小鼠采精方法的研究［J］.中國比較醫學雜志，2005，15（2）：88-91.

［5］黃宇鋒，許瑞吉.男科診斷學［M］.上海：第二軍醫大學出版社，1999：85-86.