L-蘋果酸對睡眠剝奪大鼠學習記憶的影響

鄧龍祥 陳況 葉初陽 王黎平 劉芳娥

睡眠具有維持個體生存、恢復體力及精力、促進生長發育、易化學習等功能。近年來的研究表明，不同程度的睡眠剝奪可引起機體免疫力下降、警覺性和判斷力下降、記憶力下降等變化［1］。L-蘋果酸是一種重要的天然有機酸，廣泛分布于植物、動物與微生物細胞中，其口感接近天然蘋果的酸味［2］。有研究證明L-蘋果酸可以改善腦組織的能量代謝，調整腦內神經遞質，有利于學習記憶功能的恢復，對學習記憶有明顯的改善作用［3］。但L-蘋果酸對睡眠剝奪后大鼠學習和記憶能力的影響尚未見報道。本實驗擬通過研究L-蘋果酸對睡眠剝奪后大鼠學習記憶的影響，為L-蘋果酸影響學習記憶這一理論提供更加全面的依據。

1 資料和方法

1.1 實驗動物和分組 選用健康成年雄性SD大鼠20只，體重(200±20)g(第四軍醫大學實驗動物中心提供)。經Morris水迷宮訓練之后，篩選出成績相近的大鼠16只，隨機分為2組，每組8只。對照組:SD+生理鹽水組;實驗組:SD+L-蘋果酸組。

1.2 藥品與儀器 睡眠剝奪裝置(參照文獻［4］自制)，Morris水迷宮(參照文獻［5］自制)，秒表，L-蘋果酸(藥品源自上海源葉生物科技有限公司，純度為99.9%)，灌胃針等。

1.3 給藥 實驗組每日給L-蘋果酸的劑量為10 mg/kg，配置成2 ml的溶液，每天下午17:00灌胃，對照組在相同的時間內用相同量的生理鹽水進行灌胃。1次/d，連續進行7 d，然后給予睡眠剝奪3 d。在睡眠剝奪期間，依然按分組每日給予L-蘋果酸或著生理鹽水。

1.4 睡眠剝奪模型的建立 采用多平臺水環境法(modifield multiple platform method)制備大鼠睡眠剝奪模型。使用90 cm×30 cm×30 cm的鼠箱，其中有一高15 cm，直徑6.3 cm的平臺。在平臺的周圍注滿水，水溫保持在20℃左右，水面距平臺面約1.0 cm。鼠在平臺上可以自行進食飲水。若其睡眠，則由于肌肉張力松弛而落入水中，大鼠只能重新振作精神爬上平臺，如此反復達到睡眠剝奪的效果。睡眠剝奪之前，先讓大鼠適應環境，時間為7 d，此期間在給予大鼠L-蘋果酸和生理鹽水灌胃的同時，將大鼠放在未注水的睡眠剝奪箱內，讓其熟悉環境。在7 d的熟悉環境之后，即進行72 h的睡眠剝奪。

1.5 學習記憶的測試 用Morris水迷宮法進行大鼠學習記憶的訓練與測試。水迷宮為一直徑1m，高50 cm的圓形水池，池內水深25 cm，水池按方位平均分為四個象限，設定4個入水點。在一個象限內置一高24 cm的平臺，平臺沒于水而下1 cm。水溫保持在20℃左右，平臺、水、池壁均染成白色以隱蔽平臺。實驗過程中水池及周圍環境保持不變。睡眠剝奪前對大鼠進行水迷宮學習訓練。訓練時，將大鼠面向池壁從四個入水點分別放入水池，用秒表記錄大鼠的反應時，即大鼠從入水到找到水下隱蔽平臺并站立于其上所需的時間，用秒(s)表示。大鼠找到平臺后，讓其在平臺上站立10 s，然后進行下一次的訓練。每只大鼠從四個入水點分別放入水池為一輪訓練，訓練4輪，即訓練16次，每次間隔60 s，兩次訓練之間間隔30 s。訓練成功的標志是連續4次都是60 s內找到平臺并站立于其上。淘汰訓練未成功的大鼠，本實驗16只大鼠訓練成功，淘汰4只。在睡眠剝奪40h和72 h各進行水迷宮測量一次。測量時，將大鼠面向池壁從4個入水點分別放入的反應時(s)取平均數，作為測試成績，若大鼠在60 s內未找到平臺，則以60 s計。

2 結果

將實驗組和對照組大鼠在水迷宮中的反應時數據進行單因素方差分析，SD48 h和SD72 h的差異都具有統計學顯著性(見表1)。均數間的多重比較顯示，無論SD48 h還是SD72 h，實驗組的大鼠反應時均較對照組明顯縮短(P＜0.01)。

表1 各組睡眠剝奪大鼠在水迷宮中的反應時(±s，n=8)

表1 各組睡眠剝奪大鼠在水迷宮中的反應時(±s，n=8)

注:實驗組與對照組相比P＜0.05，實驗數據有意義

時間 對照組 實驗組48 h 27.94±8.07 14.93±3.89 72 h 27.32±4.30 14.71±4.75

3 討論

已有研究表明，睡眠和記憶有密切關系［6］，睡眠剝奪對動物的短時和長時記憶、記憶的保持和鞏固都有影響。鑒于睡眠剝奪對記憶的影響已有大量的實驗證明，所以本實驗在設計時，未設正常對照組，即肯定了睡眠剝奪對記憶的不良作用。本實驗中Morris水迷宮法進行大鼠學習記憶的測試顯示，進行L-蘋果酸灌胃組的大鼠在同樣的睡眠剝奪條件下學習記憶能力明顯強于生理鹽水組，即L-蘋果酸對睡眠剝奪大鼠的學習記憶能力具有明顯的改善作用，進一步完善了L-蘋果酸可以改善腦組織的能量代謝，調整腦內神經遞質，有利于學習記憶功能的恢復，對學習記憶有明顯的改善作用［5］這一論斷。從實驗結果SD48 h比SD72 h反應時長，原因可能是Morris水迷宮訓練是在睡眠剝奪之前進行的，相隔2 d進行SD48 h記憶測試，再隔一天進行SD72 h記憶測試，前者比后者相隔時間長，遺忘較多。也就是說進行48 h記憶測試相當于又對大鼠進行了一次水迷宮學習記憶訓練，所以睡眠剝奪72 h比48 h反應時短。L-蘋果酸對于睡眠剝奪后學習記憶功能的影響為進行夜間作業的人員的保健具有重要意義，為尋找合適的保健藥物提供了一條新的思路。

［1］Corsi CM，Arce C，Del Rio Portilla IY，et al.Amplitud reduction in visual event related potentials as a function of sleep deprivation.Sleep，1999，22(1):181.

［2］吳清平，周小燕.L-蘋果酸研究進展.微生物學通報，1990，17(1):30-33.

［3］周紅宇鄭國統張士善.谷氨酸脫羧酶抑制劑L-蘋果酸對小鼠學習記憶的影響.藥學學報，1996，31(12):897-900.

［4］Sucheki D，Palma BD，Tufik S.Sleep rebound in animals deprived of paradoxical sleep by the modified multiple platform method.Brain Res，2000，875:14222.

［5］Morris R.Development of a water maze procedure for studying spacial learning in the rat.Neurosci Methods，1984，11:47.

［6］Bueno OFA，Lobo LL，Olivedra MGM，et al，Dissociated paradoxical sleep deprivation effects on inhibiting avoidance and conditioned fear.Physiol Behav，1994，56(4):775-779.