肉及肉制品中沙門氏菌活細胞的PCR檢測研究

祝儒剛，宋立峰

(1.遼寧大學輕型產業學院，遼寧省食品生物加工工程技術研究中心，沈陽市食品生物加工與質量控制技術重點實驗室，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧經濟職業技術學院，遼寧 沈陽 110122)

肉及肉制品中沙門氏菌活細胞的PCR檢測研究

祝儒剛1，宋立峰2

(1.遼寧大學輕型產業學院，遼寧省食品生物加工工程技術研究中心，沈陽市食品生物加工與質量控制技術重點實驗室，遼寧 沈陽 110036；2.遼寧經濟職業技術學院，遼寧 沈陽 110122)

將熒光染料疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)與普通聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)結合，通過對PMA的曝光時間、濃度進行優化，確定PMA-PCR區別死活細胞的最佳條件，并制作活細胞定量標準曲線，建立肉及肉制品中沙門氏菌活細胞的PMA-PCR檢測方法。結果表明：使插入死細胞DNA中的PMA活化并且光解溶液中游離PMA的最佳曝光時間為15min；不抑制沙門氏菌活細胞DNA擴增的最大PMA質量濃度為10μg/mL；完全抑制熱致死細胞DNA擴增的最小PMA質量濃度為4μg/mL。經PMA處理，含有不同比例的沙門氏菌熱致死細胞和活細胞的混合液中活的沙門氏菌能夠通過PCR被選擇性的檢測，最小檢測限為20CFU/PCR。而且，經研究發現在20～2×105CFU/PCR范圍內，電泳條帶相對熒光強度與活細胞數的對數具有線性關系。采集30份肉及肉制品樣品，利用PMA-PCR方法檢測出兩份生肉樣品中存在沙門氏菌，經過6h的富集培養后的活菌濃度分別為2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。

肉及肉制品；沙門氏菌；活細胞；PMA-PCR

沙門氏菌(Salmonella)是腸桿菌科的一類革蘭氏陰性腸道桿菌，是細菌性食物中毒中發病率最高的一種。有資料顯示，我國細菌性食物中毒中70%～80%是由沙門氏菌引起的，而在引起沙門氏菌中毒的食品中，以肉及肉制品的污染最為嚴重，世界衛生組織(World Health Organization，WHO)已將沙門氏菌列入具有嚴重危害和中等危害的食物傳播性病原[1-4]。

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術以其自身特異性強、靈敏度高和快速準確等優點已經成各類食品中病原菌快速檢測的最主要的手段[5]。然而，PCR技術不能區分所檢測到的病原菌是活菌細胞還是死菌細胞，容易導致檢測結果的假陽性，從而導致生產的大量浪費。疊氮溴化乙錠(ethidium bromide mo noa z id e，EMA)和疊氮溴化丙錠(p ro pid iu m monoazide，PMA)是兩種對DNA具有高度親和力的光敏染料，能夠選擇性地穿透死菌細胞的細胞膜，進入到細胞內部，并且插入細胞內DNA雙螺旋上[6-8]。隨后在強光作用下，已經插入到細胞內DNA雙螺旋上的EMA或者PMA可與DNA雙螺旋發生交叉偶合作用，阻止了以此DNA為模版的PCR反應的進行。但由于EMA的細胞毒性較大，其應用受到較大的限制[9]。

本研究擬將無細胞毒性的PMA與PCR技術相結合，建立肉及肉制品中沙門氏菌活細胞的定性及定量檢測方法，并通過采集實際樣品，運用該方法對肉及肉制品中的沙門氏菌活細胞進行定量檢測研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

沙門氏菌ATCC43975標準菌株 本實驗室保存。

PMA(propidium monoazide) 美國Sigma公司；Taq酶、dNTPs等PCR相關試劑 大連寶生物工程有限公司；營養肉湯(牛肉膏3g，蛋白胨5g，加水至1000mL，pH7.2～7.4)。

C-1000梯度PCR儀、Gel Doc XR+型凝膠成像系統美國Bio-Rad公司；CDYCP-31D電泳儀、電泳槽 北京六一儀器廠；752N紫外-可見分光光度計、500W鹵鎢燈 上海天普分析儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 沙門氏菌熱處理

將沙門氏菌過夜培養，取菌懸液1mL，10000r/min離心1min收集菌體，滅菌生理鹽水洗滌2次，重新懸浮于生理鹽水中。平板計數法調整菌懸液濃度為4×108CFU/mL，將0.5mL沙門氏菌菌懸液于95℃水浴處理10min，充分冷卻后將菌懸液全部涂T1N3平板，37℃條件下恒溫培養48h，觀察是否有活菌存在[10]。

1.2.2 PMA曝光時間確定

將PMA溶液(0.1mg/mL)加入9支分別裝有0.5mL熱致死沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)的離心管中，使每管PMA終質量濃度達到4μg/mL。充分混勻后，將離心管黑暗中室溫放置5min，使PMA充分滲透進入細胞內部，并且與DNA雙螺旋進行不可逆結合。將離心管開蓋置于冰上，距離燈管16cm，分別曝光0、5、10、15、20、25、30、35、40min。陽性對照不加PMA，陰性對照不加沙門氏菌菌懸液[11]。

1.2.3 不抑制活細胞PCR擴增的最大PMA質量濃度確定

9只完全一樣的離心管，每只中取0.5mL活細胞菌懸液(4×108CFU/mL)，分別加入PMA溶液(1mg/mL)使其終質量濃度分別為1、5、10、15、20、25、30、35、40μg/mL。混勻后室溫下黑暗中放置約5min。離心管開蓋放置冰上，距離燈管16cm，曝光15min。陽性對照不加PMA，陰性對照不加沙門氏菌菌懸液。

1.2.4 完全抑制死細胞PCR擴增的最小PMA質量濃度確定

10只完全一樣的離心管，每只中取0.5mL熱致死沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)，分別加入PMA溶液(1mg/mL)使其終質量濃度分別為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10μg/mL，處理方法如1.2.3節所述。陽性對照不加PMA，陰性對照不加沙門氏菌菌懸液。

1.2.5 PMA抑制熱致死沙門氏菌細胞DNA的PCR擴增能力測定

如表1所示，3組分別由活細胞和熱致死細胞混合而成的菌懸液：第1組由0.25mL固定數量(5×107CFU/mL)的熱致死細胞菌懸液與0.25mL變化數量的活細胞菌懸液(生理鹽水漂洗)混合；第2組由0.25mL滅菌生理鹽水與0.25mL變化數量的活細胞菌懸液(生理鹽水漂洗)混合，作為第1組的對照；第3組由0.25mL固定數量(5×107CFU/mL)的活細胞菌懸液(經生理鹽水漂洗)與0.25mL變化數量的熱致死細胞菌懸液混合。

表1 死活細胞混合比例Table 1 Mix proportion of viable and dead cells

每個樣品中加入PMA(0.1mg/mL)溶液，使其終質量濃度為4μg/mL。依1.2.3節方法處理后，10000r/min離心收集菌體，重懸于0.5mL的生理鹽水中，再次離心收集菌體，加50μL生理鹽水懸浮。

1.2.6 肉及肉制品中沙門氏菌活細胞檢測

樣品采自沈陽市各肉菜市場和超市，包括生肉10份(鮮肉、肝等)、熟肉制品10份(正規包裝和非包裝)、肉腸10份(正規包裝和非包裝)。生肉和非包裝樣品用專用的無菌采集袋采集，跟預先準備好的冰袋一起迅速送回分析實驗室，并在24h內做分析處理。

1.2.7 DNA 模板制備

DNA提取采用TZ裂解液(0.1mol/L Tris-HCl緩沖液，2.5mg/mL 的疊氮化納，2.0% Triton X-100，pH8.0)法[12]。

各樣品菌懸液與等體積的2×TZ裂解液混勻，沸水浴處理10min，室溫下冷卻，8000r/min離心5min去掉菌體碎片沉淀，取上清液直接用作PCR模板。

1.2.8 引物及PCR擴增

根據GenBank中已發表的沙門氏菌invA基因序列，利用Primer 5.0軟件設計一對PCR引物，上游引物(P1)為：5′-GTG AAA TTA TCG CCA CGT TCG GGC AA-3′，下游引物(P2)為：5′-TCA TCG CAC CGT CAA AGG AAC C-3′，擴增片段長度284bp。PCR反應體系：10×PCR反應緩沖液2.5μL，DNA模板4μL，dNTP(2.5mmol/L)2μL，各引物均為10pmol，MgCl2(25mmol/L)2μL，Taq酶0.2μL，用滅菌水補足到25μL體系。PCR反應程序：94℃預變性 5min，94℃ 1min、58℃ 1min、72℃ 2min，29個循環，最后72℃延伸10min。1.2.9 PCR產物檢測及定量分析

1.5%瓊脂糖凝膠電泳(6V/cm，1h)檢測PCR產物，凝膠成像系統觀察結果并成像。各DNA條帶的相對熒光強度用NIH 1.61圖像分析軟件進行相對定量分析，3次獨立實驗取平均值。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌熱處理時間

第五，學習型團隊能提高學習效率。學霸寢室學生的學習成績居于班級前列，但并不意味著他們高考成績一定最為優異。大學期間，他們之所以表現出眾，其中非常重要的原因在于他們融入了一個學習團隊，團隊成員是他們朝夕相處的室友，他們之間雖然有原生家庭帶來的差異，但這些差異并不會給團隊合作造成多少負面影響，他們相互激勵和啟發，你追我趕，因此學習效率很高，為日后成為棟梁之才打下了扎實的基礎。

沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)經95℃水浴加熱10min，冷卻，涂平板37℃培養48h，無菌落生長。因此，95℃水浴處理10min，可殺死菌懸液(4×108CFU/mL)中所有沙門氏菌活細胞。

2.2 PMA最佳曝光時間

熱致死沙門氏菌菌懸液(4×108CFU/mL)經PMA(終質量濃度4μg/mL)處理，分別曝光0～40min后，提取DNA進行PCR擴增，電泳圖譜及對應的相對熒光強度柱狀圖如圖1所示。隨著曝光時間的延長，PCR擴增條帶逐漸變弱，當曝光時間延長到15min時熒光條帶完全消失，其對應的相對熒光強度值為0，熱致死沙門氏菌DNA的PCR擴增被完全抑制。因此，在此研究中使熒光染料PMA光活化插入熱致死沙門氏菌DNA并且光解過剩的游離PMA的最佳曝光時間為15min。

圖1 激活和完全光解游離PMA的最佳曝光時間確定Fig.1 Determination of optimal light exposure time to activate and achieve complete photolysis of free PMA

2.3 不抑制活細胞PCR擴增的最大PMA質量濃度

當PMA質量濃度過大時，沙門氏菌活細胞DNA的PCR擴增也會受到不同程度的抑制作用，見圖2A。沙門氏菌活細胞菌懸液中，隨著PMA質量濃度的不斷增大，PCR擴增條帶的熒光強度也有不同程度的降低(圖2B)。對柱狀圖進行統計分析表明，當PMA質量濃度小于等于10μg/mL時，PMA對活細胞PCR擴增沒有明顯抑制作用(P＞0.05)。然而，當PMA質量濃度增加到15μg/mL時，PMA對活細胞的PCR擴增有顯著的抑制作用。因此，在本實驗中選擇不抑制活細胞PCR擴增的最大PMA質量濃度為10μg/mL。

圖2 不抑制活細胞DNA擴增的最大PMA質量濃度確定Fig.2 Determination of maximum concentration of PMA without inhibiting amplification of DNA from viable cells

2.4 完全抑制死細胞PCR擴增的最小PMA質量濃度

圖3 完全抑制死菌細胞DNA擴增的最小PMA質量濃度的確定Fig.3 Determination of minimum concentration of PMA to completely inhibit amplification of DNA from heat-killed cells

如圖3所示，對于熱致死沙門氏菌細胞，隨著PMA質量濃度的不斷增大，PCR擴增條帶越來越弱，當PMA的終質量濃度等于或者大于4μg/mL時，電泳圖譜上沒有相應的條帶出現，其對應的相對熒光強度值為0，即熱致死細胞的PCR擴增被完全抑制。此時，4μg/mL的PMA質量濃度遠遠小于可以抑制活細胞PCR擴增的PMA質量濃度10μg/mL。

2.5 PMA抑制熱致死沙門氏菌細胞DNA的PCR擴增能力確定

由定量的死菌細胞與變化量的活菌細胞以及對照組生理鹽水與變化量的活菌細胞的PCR擴增電泳圖譜如圖4所示。當PMA質量濃度為4μg/mL時，死菌細胞的PCR擴增完全被抑制，活菌細胞的PCR沒有受到影響，DNA條帶的相對熒光強度隨著活細胞數(2×106、2×105、2 × 104、2 × 103、1 × 103、2 × 102、1 × 102、20CFU/PCR)的減少而逐漸減弱，檢測限能達到20CFU/PCR。而且，由圖4C可知，在20～2×105CFU/PCR體系范圍內，DNA條帶的相對熒光強度與每個PCR反應體系中所存在的活細胞菌落數的對數值呈現線性關系，在此范圍內可以相對熒光強度來對每個PCR體系中的活菌數進行定量。

圖4 PMA抑制熱致死細胞DNA的PCR擴增能力及對活細胞的定量曲線Fig.4 Inhibitory capability of PMA against PCR amplification of DNA derived from heat-killed cells and quantitative curve for viable cells

圖5 固定量的活細胞與變化量的熱致死細胞混合液的PMA-PCR擴增結果Fig.5 PMA-PCR amplification derived from mixtures with a constant number of viable cells and various numbers of dead cells

定量的活細胞與變化量的熱致死細胞混合液中(圖5)，死細胞的PCR擴增完全被PMA抑制，活細胞的PCR沒有受到影響。因此，對應PCR擴增電泳圖譜每個條帶的亮度均勻一致，其對應相對熒光強度值也無顯著差異。

2.6 肉及肉制品樣品中沙門氏菌活細胞檢測

分別利用傳統分離培養法和PMA-PCR技術對30份肉及肉制品樣品進行了沙門氏菌活細胞檢測。結果表明，經過6h的富集培養后，傳統分離培養法和PMAPCR法均檢測出兩份生肉樣品中含有沙門氏菌活細胞。利用圖4C的標準曲線可得，6h富集后的菌濃度分別為2.5×103CFU/mL和3.4×103CFU/mL。

3 結 論

隨著社會的發展和人類文明的進步，人們對食物品質的要求越來越高，因此準確、快速地檢測食品中的沙門氏菌，對于預防人類沙門氏菌感染具有十分重要的意義[13-14]。

本研究將熒光染料PMA應用于普通PCR技術，利用PMA不能穿透活細胞的細胞壁和細胞膜卻能夠滲透到細胞壁或細胞膜不完整的死細胞體內的特性，使其插入DNA并與其共價結合，從而抑制死細胞DNA的PCR擴增，而活細胞的PCR擴增不受影響，更加精確地檢測肉及肉制品中沙門氏菌活細胞的存在。結果表明，當PMA質量濃度不低于4μg/mL時，可以完全抑制沙門氏菌死細胞DNA的PCR擴增，高于擬桿菌的2.2μg/mL和大腸桿菌的3μg/mL，但是明顯低于軍團藻的8.8μg/mL。當PMA質量濃度小于10μg/mL時，PMA不會對活細胞PCR擴增產生顯著影響，此時的PMA質量濃度比大腸桿菌的20μg/mL、軍團藻的17.6μg/mL以及擬桿菌的10.5μg/mL 都要低[15-17]。

變化量的活菌細胞與定量的死菌細胞混合液，經EMA處理后，在20～2×105CFU/PCR范圍內，沙門氏菌活細胞DNA擴增產物的相對熒光強度與每個PCR反應體系中所存在的活細胞DNA的拷貝數的對數值呈現嚴格的線性關系，據此可對各種肉及肉制品中的沙門氏菌活細胞進行定量分析。

[1] 史沁紅, 任秀龍. 肉制品中沙門氏菌檢測方法的研究進展[J]. 肉類研究, 2009, 23(10): 75-79.

[2] 方平, 楊永莉, 楊寶, 等. Real-time PCR方法檢測肉品中的沙門氏菌[J]. 山西農業科學, 2010, 38(8): 71-76.

[3] 周麗萍, 巢國祥. 生肉制品中沙門菌、單核細胞增生李斯特菌及金黃色葡萄球菌流行特性研究[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2007, 17(3): 505-507.

[4] 許學斌, 顧寶柯, 袁政安, 等. 富營養預增菌液在肉制品沙門菌常規檢測方法中替代效果研究[J]. 中國人獸共患病學報, 2006, 22(7): 633-635.

[5] 尹榮煥, 尹榮蘭, 楊玉英, 等. PCR技術檢測熟肉制品中沙門氏菌的研究[J]. 安徽農業科學, 2006, 34(2): 222-226.

[6] 趙玉玲, 張天生, 張巧艷. PCR法快速檢測肉食品污染沙門菌的實驗研究[J]. 微生物學雜志, 2010, 30(3): 103-105.

[7] LEE J M, LEVIN R E. A comparative study of the ability of EMA and PMA to distinguish viable from heat killed mixed bacterial flora from fish fillets[J]. Journal of Microbiological Methods, 2009, 64(7): 93-96.

[8] RUDI K, MOEN B, DROMTORP S, et al. Use of ethidium monoazide and PCR in combination for quantification of viable and dead cells in complex samples[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005,71(2): 1018-1024.

[9] NOCKER A, CHEUNG C Y, CAMPER A K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells[J]. Journal of Microbiological Methods, 2006, 67(2): 310-320.

[10] 祝儒剛, 呂淑霞, 劉月萍, 等. 基于DNA染料EMA的RT-PCR技術定量檢測海產品中病原性副溶血弧菌活細胞[J]. 食品科學, 2011, 32(8): 219-225.

[11] 祝儒剛, 呂淑霞, 劉月萍, 等. 基于DNA染料EMA的PCR技術檢測鑒別副溶血性弧菌死活細胞[J].食品與發酵工業, 2010, 36(7): 144-149.

[12] ABOLMAATY A, VU C, OLIVER J, et al. Development of a new lysis solution for releasing genomic DNA from bacterial cells for DNA amplification by polymerase chain reaction[J]. Microbios, 2000, 101(4): 181-189.

[13] 周曉紅, 孫明華, 徐佩華, 等. 生肉制品中沙門菌污染狀況及耐藥性分析[J]. 中國衛生檢驗雜志, 2010, 20(12): 3425-3427.

[14] 王羽, 王貞強, 張偉. 環介導等溫擴增技術檢測肉及肉制品中的沙門氏菌[J]. 食品科學, 2010, 31(6): 270-273.

[15] SUNGWOO B, STEFAN W. Discrimination of viable and dead fecal bacteroidales bacteria by quantitative PCR with propidium monoazide[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(9): 2940-2944.

[16] CHANG B, TAGURI T, SUGIYAMA K, et al. Comparison of ethidium monoazide and propidium monoazide for the selective detection of viable legionella cells[J]. Japanese Journal of Infectious Diseases, 2010, 63(4):119-123.

[17] 羅劍飛, 林煒鐵, 郭勇. PMA與PCR結合的細菌活細胞檢測方法[J].華南理工大學學報, 2010, 38(9): 142-146.

Detection of ViableSalmonellaCells in Meat and Meat Products by PCR

ZHU Ru-gang1，SONG Li-feng2
(1. Shenyang Key Laboratory of Food Biology Processing and Quality Control Technology, Engineering Technology Research Center for Food Biology Processing of Liaoning Province, College of Light Industry, Liaoning University, Shenyang 110036, China；2. Liaoning Economic Management Cadre Institute, Shenyang 110122, China)

A method for the selective detection of viable cells ofSalmonellain meat and meat products was developed using propidium monoazide (PMA) staining in combination with conventional PCR (PMA-PCR). Exposure time and PMA concentration were optimized to find optimal PMA-based PCR conditions for distinguishing between dead and viable cells. The results showed that the optimal light exposure time to activate PMA in dead cells and to photolyze free PMA in solution was 15 min.PMA at a dose of 10 μg/mL or less could not inhibit PCR amplification of DNA derived from viable cells ofSalmonella. The minimum concentration of PMA to completely inhibit PCR amplification of DNA derived from heat-killed cells was 4 μg/mL.After PMA treatment, viableSalmonellacells in a mixture containing different proportions of viable and dead cells could be selectively detected by PCR, and the minimum detection level was 20 CFU/PCR. An excellent linear relationship was observed between relative fluorescent intensity of DNA bands and lgCFU in the range of 20 － 2 × 105CFU/PCR. Among 30 meat and meat product samples, two samples were detected by the developed PMA-PCR method as being positive after 6 h enrichment with average amounts of 2.5 × 103CFU/mL and 3.4 × 103CFU/mL for viableSalmonellacells, respectively.

meat and meat products；Salmonella；viable cells；propidium monoazide-based polymerase chain reaction(PMA-based PCR)

TS201.6

A

1002-6630(2012)16-0199-05

2011-11-11

遼寧大學青年科學基金項目(2009LDQN21)

祝儒剛(1980—)，男，講師，博士，研究方向食品微生物與分子生物學。E-mail：zrg_luck@163.com