固相萃取-流動注射化學發光法測定動物肝臟中的鹽酸二氟沙星

朱盈蕊，高向陽*，趙 琛

(河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

固相萃取-流動注射化學發光法測定動物肝臟中的鹽酸二氟沙星

朱盈蕊，高向陽*，趙 琛

(河南農業大學食品科學技術學院，河南 鄭州 450002)

堿性條件下，基于鹽酸二氟沙星對魯米諾-過氧化氫化學發光反應體系的抑制作用，樣品經固相萃取柱處理后用該體系測定，建立快速分析豬肝、雞肝中鹽酸二氟沙星的流動注射化學發光新方法。結果表明：鹽酸二氟沙星質量濃度在1.00×10-5～1.00×10-9mg/mL范圍內，質量濃度的負對數與體系的相對化學發光強度呈良好線性關系，方法檢出限為4.07×10-9mg/mL，相對標準偏差(RSD)為0.93%(n=11)。該方法用于動物肝臟中鹽酸二氟沙星殘留的檢測，結果令人滿意。

鹽酸二氟沙星；流動注射化學發光法；動物肝臟；固相萃取

鹽酸二氟沙星(difloxacin hydrochloride，DIF)是一類動物專用氟喹諾酮類藥物，具有抗菌譜廣、殺菌效強、口服吸收迅速、半衰期長、與其他抗菌藥物無交叉耐藥性、低毒、高效等特點，對畜禽呼吸道致病菌有良好的抗菌活性，主要用于治療豬和禽類的敏感細菌及支原體所致的各種感染性疾病[1-2]，該類藥物的研究已有文獻報道[3-5]。抗菌藥因其治療效果優異，廣泛應用于疾病的預防和控制，其中包括氟喹諾酮類藥物。隨著該類藥物使用量的增大，各種毒副作用逐漸顯現，會引起惡心、嘔吐、頭痛、心悸等直接毒性反應，還可引起光毒性皮炎，而逐漸受到人們的高度關注，國家農業部對動物性食品中獸藥最高殘留限量做了規定[6]。因此，研究鹽酸二氟沙星在動物性食品中的殘留，對保障食品安全和維護人體健康有一定的現實意義。

目前，二氟沙星殘留的主要分析方法有高效液相色色譜-質譜聯用法[7-9]、超高液相色譜-質譜聯用法[10-13]、高效液相色譜法[14]、酶聯免疫法[15-16]等。前兩種方法設備昂貴，酶聯免疫法操作復雜，有時無法滿足工作需要。流動注射化學發光法具有快速簡便、設備簡單、靈敏度高、重復性好、線性范圍寬、自動化程度高的顯著特點，已廣泛應用于藥物分析、環境監測等領域[17-20]，但未見有流動注射化學發光法分析食品中鹽酸二氟沙星的報道。本實驗擬建立一種快速測定鹽酸二氟沙星的新方法，可用于動物肝臟中微量鹽酸二氟沙星的測定。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞肝、豬肝 市售。

鹽酸二氟沙星標準品(質量分數99.8%) 中國獸醫藥品監察所；的魯米諾(質量分數＞99%) 蘇州工業園區亞科化學試劑有限公司；過氧化氫(質量分數30%) 煙臺市雙雙化工有限公司；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，實驗用水為石英亞沸二次重蒸水。

0.20mg/mL鹽酸二氟沙星儲備液：準確稱取0.0050g鹽酸二氟沙星標準品，用重蒸水溶解后定容于25mL棕色容量瓶，4℃冰箱中保存，使用時用重蒸水逐級稀釋至所需濃度；1.0×10-2mol/L魯米諾貯備液：準確稱取魯米諾0.4425g用0.10mol/L氫氧化鈉溶液溶解并定容于250mL棕色容量瓶中，混勻避光保存兩周后使用，并逐級稀釋到所需濃度；0.20mol/L過氧化氫溶液：準確吸取30%過氧化氫溶液5.10mL，用重蒸水定容于250mL棕色容量瓶中，混勻、備用，過氧化氫溶液需現配現用；0.10mol/L磷酸鹽緩沖溶液：取磷酸二氫鉀6.8g，加水溶解并定容于500mL。

1.2 儀器與設備

IFFM-D型流動注射生物發光分析儀 西安瑞邁電子科技有限公司；固相萃取裝置(配C8柱) 美國Agilent公司；SKF-12超聲波清洗器(額定功率500W) 上海科導超聲儀器有限公司；FA2004A電子天平 上海精天電子儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機 力康發展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準曲線的繪制

圖1 流動注射化學發光流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of flow injection chemiluminescence analysis

用0.20mg/mL鹽酸二氟沙星儲備液配制成1.00×10-4mg/mL標準溶液，依次配制1.00×10-5、1.00×10-6、1.00×10-7、1.00×10-8、1.00×10-9mg/mL標準系列溶液，備用。同時配制空白溶液，按儀器工作參數測定，待儀器基線穩定后，注入標準溶液，記錄其發光強度(I標)，設空白的化學發光強度為(I0)，以鹽酸二氟沙星質量濃度的負對數為橫坐標，以ΔI＝I0－I標為縱坐標繪制標準曲線。流動注射化學發光反應裝置見圖1。

1.3.2 樣品的測定

樣品用醫用剪刀剪成塊，勻漿，準確稱取2.0000g于離心管中，準確加磷酸鹽緩沖液10.00mL，在額定功率為500W超聲波清洗器中超聲5min后，12000r/min離心10min，取樣品上清液過固相萃取柱。

固相萃取柱先用甲醇、磷酸鹽緩沖液各2.00mL依次預洗。準確取樣品上清液2.00mL注入，用體積比1:19的甲醇-磷酸鹽混合液4.00mL，以10～15滴/min流速淋洗。棄去淋洗液后，用體積比1:19的氨水-甲醇混合溶液4.00mL，以10～15滴/min流速洗脫，定量收集洗脫液，于60～70℃氮氣下吹干，加少量重蒸水溶解并定容于50mL棕色容量瓶中，同時處理和配制樣品空白溶液，待測定。

在與標準曲線完全相同的條件下測定空白溶液和樣品定容液的發光強度之差ΔIx＝I0－I樣，代入標準曲線回歸方程，求出樣品定容液中鹽酸二氟沙星的質量濃度(ρ)，按下式計算樣品中鹽酸二氟沙星的質量分數(ω)。

式中：m為稱取樣品的質量/g；ρ為鹽酸二氟沙星的質量濃度/(mg/mL)。

2 結果與分析

2.1 測定條件的選擇

2.1.1 化學發光儀工作參數的設定

光電倍增管負高壓為450V、儀器增益為1時，對化學發光儀工作參數進行優化，結果表明儀器在表1參數下運行，發光信號穩定，且具有較大的信噪比。

表1 化學發光儀工作參數的設定Table 1 Working parameters of chemiluminescence instrument

2.1.2 反應介質及其濃度的選擇

當魯米諾濃度6.0×10-4mol/L，過氧化氫濃度0.050mol/L時，分別以0.10mol/L NaOH、Na2CO3、NaHCO3溶液為反應介質，按2.1.1節儀器工作參數，測定不同堿性介質對魯米諾-過氧化氫化學發光體系的影響。實驗表明：反應介質為氫氧化鈉時，體系產生的化學發光強度較為理想。相同條件下，考察0.050～0.35mol/L氫氧化鈉溶液對化學發光體系的影響，結果如圖2所示。

圖2 氫氧化鈉濃度對相對化學發光強度的影響Fig.2 Effect of sodium hydroxide concentration on relative luminescence intensity

由圖2可知，氫氧化鈉濃度為0.10mol/L時，化學發光強度最大，選擇0.10mol/L氫氧化鈉為反應介質。

2.1.3 魯米諾濃度的選擇

氫氧化鈉濃度為0.10mol/L、過氧化氫濃度為0.050mol/L，按2.1.1節儀器工作參數運行，考察魯米諾在1.0×10-4～1.0×10-3mol/L范圍內對化學發光強度的影響，見圖3。

圖3 魯米諾濃度對相對化學發光強度的影響Fig.3 Effect of luminol concentration on relative luminescence intensity

圖3表明：當魯米諾濃度大于6.0×10-4mol/L，體系化學發光強度較大且基本保持穩定，實驗選取魯米諾濃度為7.0×10-4mol/L。

2.1.4 試劑混合方法和放置時間的影響

考察魯米諾與氫氧化鈉混合溶液、過氧化氫與氫氧化鈉混合溶液兩種不同混合方法對體系化學發光強度的影響。在相同條件下測定，結果表明過氧化氫與氫氧化鈉混合溶液對同濃度魯米諾溶液的相對化學發光值較大且穩定。

當混合液中氫氧化鈉濃度0.10mol/L，過氧化氫濃度0.050mol/L時，在魯米諾濃度7.0×10-4mol/L條件下，按2.1.1節儀器工作參數運行，考察混合溶液混合放置5～25min時，放置時間對化學發光強度的影響，結果表明：混合時間為12min時化學發光強度最大且穩定。

2.1.5 過氧化氫濃度的選擇

氫氧化鈉濃度為0.10mol/L、魯米諾濃度為7.0×10-4mol/L，混合12min，按2.1.1節儀器工作參數實驗，考察過氧化氫濃度在0.01～0.30mol/L范圍內對化學發光強度的影響，見圖4。

圖4 過氧化氫濃度對相對化學發光強度的影響Fig.4 Effect of hydrogen peroxide concentration on relative luminescence intensity

圖4表明：過氧化氫濃度為0.15～0.30mol/L時，體系化學發光強度較大且基本穩定，實驗選擇過氧化氫濃度為0.20mol/L。

2.2 洗脫液用量的確定

按照1.3.2節中固相萃取柱的操作方法，用體積比1:19的氨水-甲醇混合溶液4.00mL，以10～15滴/min流速洗脫，定量收集洗脫液后，另取3.00mL相同的氨水+甲醇混合溶液再繼續洗脫時沒有測定信號，表明用4.00mL洗脫液即可以洗脫完全。

2.3 干擾實驗

在優化實驗條件下，對1.00×10-7mg/mL鹽酸二氟沙星進行干擾實驗，在相對誤差±5%范圍內，100倍K+、Na+、Mg2+、SO42－、Cl－；50 倍 Ca2+、Fe2+、NO3－均不產生干擾。

2.4 相關系數、檢出限和定量限

優化實驗條件下，按1.3.1節方法以鹽酸二氟沙星質量濃度的負對數為橫坐標，相對化學發光強度差值ΔI=I0－I標為縱坐標，繪制標準曲線可知，鹽酸二氟沙星質量濃度在1.00×10-5～1.00×10-9mg/mL實驗范圍內，質量濃度的負對數與化學發光強度有良好線性關系，線性方程為y＝－24.4x＋245.3，相關系數r為0.9956。對空白溶液進行11次平行測定的檢出限(RSN＝3)為4.07×10-9mg/mL，平行測定的RSD為0.93%，定量限(RSN＝10)為1.36×10-8mg/mL。

2.5 測定結果及回收率

在優化實驗條件下，樣品按1.3.2節處理后上機測定，于5min內可完成分析，測定結果以平均值報告，同時進行加標回收率實驗，結果見表2。

表2 樣品測定結果及回收率Table 2 Recovery rates of difloxacin hydrochloride from spiked positive pork and chicken liver samples

由表2可知，豬肝和雞肝樣品均未檢出鹽酸二氟沙星，加標回收率分別為59.00%～78.63%和52.50%～72.63%。標準加入量為同一個數量級時，化學發光法與液質聯用法測定氟喹諾酮類藥物的加標回收率51.4%～72.5%相一致[21]。

3 結 論

在氫氧化鈉堿性介質中，過氧化氫氧化魯米諾產生化學發光，微量鹽酸二氟沙星能有效抑制相對化學發光強度。通過對測定條件的優化，建立了魯米諾-過氧化氫化學發光體系測定動物組織中鹽酸二氟沙星的新型分析方法，用于測定豬肝中鹽酸二氟沙星的加標回收率達78.63%，測定雞肝中鹽酸二氟沙星的加標回收率達72.63%，檢出限為4.07×10-9mg/mL，定量限為1.36×10-8mg/mL，該法儀器簡單、操作簡便、成本低廉，具有快速、靈敏、準確、成本低廉的顯著優點，有較好的推廣應用價值。

[1] 王福傳, 董希德. 獸藥手冊[M]. 北京: 中國農業出版社, 2008: 104.

[2] 中國獸藥雜志編輯部. 獸醫專用氟喹諾酮類藥物[J]. 中國獸藥雜志,2003, 37(6): 44-47.

[3] 曾振靈, 丁煥中, 黃顯會, 等. 二氟沙星在豬體內的藥物動力學及生物利用度研究[J]. 中國農業科學, 2003, 36(7): 846-850.

[4] 丁方科. 不同溫度下鹽酸二氟沙星在鯽體內的藥物動力學及殘留研究[D]. 武漢: 華中農業大學, 2006.

[5] 張艷, 彭麟, 賀培益, 等. 鹽酸二氟沙星混懸乳注射液的急性毒性和蓄積毒性[J]. 江蘇農業科學, 2011, 39(4): 260-262.

[6] 農業部畜牧獸醫局. 農業部發布動物性食品中獸藥最高殘留限量(續)[J]. 中國獸藥雜志, 2003, 37(3): 5-11.

[7] 李雅麗, 郝曉蕾, 冀寶慶, 等. HPLC-ESI-MS/MS 測定動物性食品中19種喹諾酮類藥物殘留的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(3): 502-506.

[8] 李彬彬, 侯玉澤, 樊建紅, 等. 獸用抗菌藥鹽酸二氟沙星的研究及其殘留檢測[J]. 上海畜牧獸醫通訊, 2008(6): 75-77.

[9] 饒勇, 曾振靈, 楊桂香, 等. 液相色譜-質譜聯用檢測牛奶中氟喹諾酮類藥物殘留的確證方法[J]. 中國農業科學, 2007, 40(5): 1033-1041

[10] 劉正才, 楊方, 李耀平, 等. UPLC -MS /MS對鰻魚中26種喹諾酮類及磺胺類抗生素藥物殘留的快速測定[J]. 分析測試學報, 2008, 27(11): 1171-1175.

[11] 郭黎明, 朱奎, 江海洋, 等. 超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定雞肝中殘留的四環素類、磺胺類和喹諾酮類藥物[J]. 色譜, 2009,27(4): 412-416.

[12] 李鋒格, 蘇敏, 李曉巖, 等. 分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定雞肝中磺胺類、喹諾酮類和苯并咪唑類藥物及其代謝物的殘留量[J]. 色譜, 2011, 29(2): 120-125.

[13] FATIMA T, FABIEN M, JOELLE E, et al. Ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry performance evaluation for analysis of antibiotics in natural waters[J]. Anal Bioanal Chem, 2009,393(6/7): 1709-1718.

[14] LI Cun, JIANG Haiyang, ZHAO Sijun, et al. Simultaneous determination of fluoroquinolones and sulfonamides in chicken muscle by LC with fluorescence and UV detection[J]. Chromatographia, 2008, 68(1/2): 117-121.

[15] 潘孝成, 祁克宗, 朱良強, 等. 氟喹諾酮類藥物的多殘留酶免疫分析研究[J]. 中國畜牧獸醫, 2007, 34(11): 126-129.

[16] JAVIER A, DANIEL G P, BENOIT G, et al. A multianalyte ELISA for immunochemical screening of sulfonamide, fluoroquinolone and S-lactam antibiotics in milk samples using class-selective bioreceptors[J]. Anal Bioanal Chem, 2008, 391(5): 1703-1712.

[17] 王長青, 高向陽, 石含玉. 流動注射偶合化學發光法快速測定食品塑料袋中可浸出有機化合物的總量[J]. 食品科學, 2010, 31(20): 367-370.

[18] 嵇正平, 王俊, 韓靜, 等. 流動注射化學發光法檢測甲醛含量的研究[J]. 分析試驗室, 2011, 30(8): 23-26.

[19] 劉梅, 崔香. 流動注射化學發光法測定鹽酸溴己新[J]. 光譜實驗室,2011, 28(5): 2373-2375.

[20] 蘭文菊, 彭密軍, 彭勝, 等. 菜籽粕脫毒液中植酸的提取及其抗氧化活性[J]. 食品科學, 2011, 32(17): 172-175.

[21] 趙楊, 鄭志明, 金社勝, 等. 液質聯用法同時測定豬糞便中16種(氟)喹諾酮類藥物殘留[J]. 農業環境科學學報, 2011, 30(6): 1248-1253.

Determination of Difloxacin Hydrochloride Residue in Animal Liver by Solid Phase Extraction and Flow Injection Chemiluminescence

ZHU Ying-rui，GAO Xiang-yang*，ZHAO Chen
(College of Food Science and Technology, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

A new quick method for the determination of difloxacin hydrochloride residue in pork and chicken livers using solid phase extraction followed by flow injection chemiluminescence analysis was presented based on the inhibition of chemiluminescence generation from the reaction between luminol and hydrogen peroxide by difloxacin hydrochloride. The results showed that an excellent linear relationship between chemiluminescence intensity and negative logarithm of difloxacin hydrochloride concentration was observed in the range of 1.00 × 10-5－1.00×10-9mg/mL. The limit of detection for difloxacin hydrochloride was 4.07 × 10-9mg/mL. The precision was 0.93% (relative standard deviation, RSD) for eleven replicate determinations. Therefore,this method can be used for the determination of difloxacin hydrochloride in animal liver with satisfactory results.

difloxacin hydrochloride；flow injection chemiluminescence；animal liver；solid phase extraction

O657.3；R917

A

1002-6630(2012)16-0184-04

2012-02-20

河南省重點學科建設基金項目(10466-X-082301)

朱盈蕊(1986—)，女，碩士研究生，主要從事食品安全、現代食品分析技術研究。E-mail：zhuyanan521 @163.com

*通信作者：高向陽(1949—)，男，教授，主要從事食品分析、食品資源開發研究。E-mail：ndgaoxy@163.com