北五味子種子和果肉中的活性成分比較

李立順，時維靜*，馬迅兵

(安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

北五味子種子和果肉中的活性成分比較

李立順，時維靜*，馬迅兵

(安徽科技學院食品藥品學院，安徽 鳳陽 233100)

目的：比較北五味子種子和果肉中活性成分的差異。方法：采用薄層色譜法比較北五味子種子、果肉和果實中木脂素成分含量；采用苯酚-硫酸法測定種子、果肉和果實及果肉不同組分糖的含量；薄層色譜法分析三氟乙酸水解后，果肉不同組分單糖組成。結果：北五味子木脂素類主要在種子中；北五味子在果肉和種子中的總糖含量分別為169.34、5.366mg/g；果肉中各組分糖含量分別為醇溶組分117.06mg/g、醇沉組分75.67mg/g、多糖組分12.37mg/g。三氟乙酸水解后薄層分析，醇溶組分主要由葡萄糖組成，多糖組分主要由葡萄糖、半乳糖組成。結論：北五味子種子和果肉中活性成分存在明顯差異。

北五味子；種子；果肉；木脂素；多糖

北五味子為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實，主產于遼寧、黑龍江、吉林、內蒙古等地。五味子始載于《神農本草經》，作為名貴中藥具有悠久的歷史，不僅有良好的醫療保健作用，也是國家衛生部公布的藥食同源品之一。

現代藥理研究表明，五味子有保肝益腎、保護心腦血管、鎮痛、鎮靜、催眠、抗衰老、抗腫瘤、降血糖和免疫增強作用[1]。五味子主要含木脂素(8%)[2]、多糖(11.98%)[3]、揮發油、三萜、有機酸、氨基酸和無機元素等。《中國藥典》(2010年版)規定，五味子藥材中含五味子醇甲不得少于0.40%[4]。國內外對五味子的活性成分研究多集中在木脂素和多糖[5-8]。本實驗比較北五味子果實，種子和果肉中活性成分的差異，為更好地利用五味子開發保健食品提供參考，也為臨床用藥、炮制和生產提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 藥材與試劑

北五味子(產地：遼寧)購于安徽省亳州市。經安徽科技學院食品藥品分析檢測中心時維靜教授鑒定為木蘭科植物五味子Schisandra chinensis(Turcz.) Baill.的干燥成熟果實。

對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。五味子甲素(批號：110764-200408)、五味子乙素(批號：110765-20050)、五味子醇甲(批號：110857-200709)、鼠李糖(批號：111683-200401)；D-阿拉伯糖(批號：111506-200001)；蔗糖(批號：111507-200001)；D-無水葡萄糖(批號：110833-200904)；乳糖(批號：111646-200301)；半乳糖(批號：100226-200404)；D-木糖(批號：111508-200404)；高效硅膠G、GF254薄層板(規格：20cm×10cm，批號：20090724) 青島海洋化工廠；超純水；三氟乙酸、重蒸酚等均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

CAMAG TLC SCANNER 3薄層掃描儀、LINOMAT 5半自動點樣儀、TCL VISALIZER薄層色譜成像文件系統 瑞士Camag公司；CP225D準微量天平 德國賽多利斯公司；TU-1810SPC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 果實及果肉和種子的分離制備

取北五味子果實500g，50℃干燥12h，置干燥器中放涼。精密稱取100.00g三份，分別加水潤透，分離果肉與種子，再置干燥箱中50℃干燥，放涼，稱量，記錄。

1.2.2 種子、果肉和果實中木脂素類測定

1.2.2.1 對照品溶液的制備

精確稱取北五味子甲素，五味子乙素，五味子醇甲對照品：2.0、1.8、3.0mg分別置2mL容量瓶中，加二氯甲烷溶解定容，搖勻，即得。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

精密稱取五味子種子、果肉和果實粉末1.00g，分別置具塞三角燒瓶中，加二氯甲烷20mL，超聲提取(功率250W，頻率35kHz)30min，濾過，濾液蒸干，殘渣加二氯甲烷溶解，定容至2mL作為供試品液。

1.2.2.3 薄層色譜條件與檢測

取20cm×10cm硅膠GF254高效薄層板，110℃活化30min；采用半自動點樣儀噴霧點樣，帶寬6.00mm；底邊高度10mm；點樣量：供試品溶液，果肉4μL、種子2μL、果實2μL，均為2個重復；對照品溶液分為高濃度(S1)和低濃度(S2)分別點于同一軌道，五味子乙素5、1μL；五味子甲素3、0.5μL；五味子醇甲4、1μL，3個重復。樣品和對照品共12個軌道在同一薄層板上。以石油醚(30～60℃)-甲酸乙酯-甲酸(15:5:1，V/V)為展開劑，于雙槽展開缸預飽和20min，薄層板平衡20min，上行展開展距8cm。室溫18℃，相對濕度約55%。

展開后，揮干溶劑，于薄層色譜成像系統254nm波長處拍攝熒光薄層色譜圖。

使用薄層掃描儀，單波長反射直線掃描法，λ＝254nm，狹縫4.00mm×0.30mm，掃描速率20mm/s獲得掃描光譜圖。采用外標兩點法，進行線性回歸。

對薄層板的同一斑點每間隔1～2h掃描測定一次，考查12h內的穩定性。精密吸取對照液各2μL，分別點于同一薄層板上，共5個點，依法展開、掃描測定，進行精密度考查。采用樣品與對照品同板點樣、展開、掃描，外標兩點法測定，線性回歸方程計算含量。

1.2.3 北五味子種子、果肉和果實總糖檢測

1.2.3.1 供試品溶液的制備

精密稱取干燥的北五味子果肉、種子和果實粉末各2.0g, 置于索氏提取器中，加入石油醚(60～90℃)水浴回流提取3次，每次1h，棄提取液。將藥粉揮干溶媒后，置于圓底燒瓶中，加蒸餾水100mL，加熱回流提取3次，每次1h，合并濾液，水浴濃縮后，定容至250mL，備用。

1.2.3.2 標準系列溶液的制備

精密稱定1 0 5℃干燥至質量恒定的無水葡萄糖10mg，定容于10mL容量瓶中，搖勻，配制成質量濃度為1g/L的儲備液。從儲備液中分別精密移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL置于6個10mL容量瓶中，定容，配制成10、20、40、60、80、100mg/L的葡萄糖標準系列溶液。

1.2.3.3 標準曲線的繪制

精密移取葡萄糖標準系列溶液各1.0mL，空白取1.0mL水，分別置于10mL試管中，各加5%重蒸酚1.0mL后充分振搖，在迅速加入濃硫酸5.0mL，振搖，室溫放置30min后，于488nm波長處測定吸光度。以質量濃度(C)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標，進行線性回歸，得到回歸方程為A＝0.00787C＋0.00485(R2＝0.9995)。結果表明，葡萄糖在 10～100mg/L范圍內與吸光度呈良好線性關系。

1.2.4 果肉不同組分糖的測定及酸水解

1.2.4.1 果肉不同組分制備

精密稱取干燥果肉粉末2.00g，按1.2.3.1節的方法提取，將濾液用活性炭除色后濃縮，加乙醇，使含乙醇體積分數達80%，4℃放置24h，4800r/min、20min離心分離，得醇沉組分(粗多糖)和醇溶組分(單糖、低聚糖等)，80℃真空干燥48h，計算得膏率。另取干燥果肉粉末5.00g，按上法制得果肉粗多糖，用少量蒸餾水稀釋，Sevag法反復多次脫蛋白，再用氯仿、丙酮、無水乙醇依次洗滌多次，干燥，得精制多糖粉末，稱量，計算得率。

1.2.4.2 對照品溶液制備

分別稱取干燥至質量恒定的葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖對照品1.5、1.2、1.8、0.8、1.1、0.9、2.0mg，分別用超純水定容于1mL容量瓶中，得糖對照品溶液。

1.2.4.3 供試品溶液制備

稱取精制多糖24.20mg，醇溶組分34.20mg，置安培瓶中，分別加入2mL 2mol/L三氟乙酸溶液，封口后于110℃水解4h，冷卻后，過濾除去不溶物，用N2除去多余的三氟乙酸。分別用蒸餾水定容至10mL容量瓶，備用。

1.2.4.4 薄層色譜條件

取高效硅膠G板，110℃活化30min，半自動點樣儀噴霧點樣，帶寬6.00mm；底邊高度10mm；對照品與供試品同板點樣各2μL，以正丁醇-乙酸乙酯-異丙醇-醋酸-水-吡啶(7:20:12:7:6:6，V/V)為展開劑，上行展開8cm，取出，晾干。噴苯胺-二苯胺溶液顯色劑，110℃烘至斑點清晰。于薄層色譜成像系統白光下拍攝。

2 結果與分析

2.1 五味子果肉和種子占果實的比率

將果實分離的果肉與種子，精密稱量，計算出果肉和種子占果實的百分比，結果見表1。

表1 北五味子果實中種子和果肉含量Table 1 Percentages of seed and flesh in Schisandrae chinensis Fructus

2.2 果實、種子和果肉中木脂素類成分的比較

2.2.1 薄層色譜定性比較

按1.2.4.4節的方法進行實驗，由254nm波長處拍攝的熒光薄層色譜圖(圖1)可以看出，樣品分離良好，對照品從上至下依次為五味子乙素、五味子甲素、五味子醇甲。從相對應的色譜條帶，可清晰對比出同一質量分數下種子的3種成分高于果實；果肉雖加倍點樣量，也極微量。表明五味子木脂素類成分主要存在種子中。

圖1 北五味子果肉、種子、果實及對照品的薄層色譜圖Fig.1 HPTLC profile of mixed deoxyschizandrin, γ-schizandrin and schisandrin standards and Soxhlet extracts from fresh, seed and whole fruit of Schisandrae chinensis Fructus

2.2.2 薄層掃描含量測定

按1.2.4.4節的方法，樣品與對照品同板點樣、展開、掃描、測定。穩定性考查結果顯示，斑點在12h內穩定，相對標準偏差為1.7%(n＝5)。精密度考查對照液5個點，相對標準偏差為1.9(n＝5)。采用外標兩點法，得回歸方程為：Y乙素＝2923.660＋3.101X(r＝0.99970，s＝1.76%)；Y甲素＝2313.764＋4.365X(r＝0.99942，s＝2.65%)；Y醇甲＝8249.184＋1940.532X(r＝0.99932，s＝1.47%)。乙素、甲素、醇甲分別在0.9～4.5、0.5～3.0、1.5～6.0μg范圍內呈良好線性關系。五味子果實、種子和果肉薄層掃描色譜峰圖(圖1)和三維圖(圖2)可比較3者的差異，果實、種子和果肉中五味子甲素、乙素、醇甲的含量測定結果見表2。

圖2 五味子果實、種子和果肉薄層掃描三維圖譜Fig.2 Three-dimension (3D) TLC of Soxhlet extracts from fresh, seed and whole fruit of Schisandrae chinensis Fructus

表2 果實、種子和果肉中五味子甲素、乙素、醇甲的含量Table 2 Contents of deoxyschizandrin,γ-schizandrin and schisandrin in whole fruit, seed and flesh of Schisandrae chinensis Fructus

2.3 種子、果肉和果實中總糖含量比較

光譜掃描結果在488nm波長處有最大吸收(圖3)。取果肉、種子和果實供試品溶液1mL分別定容于25mL量瓶中，精密移取1.0mL，按1.2.3.3節標準曲線的方法測定其吸光度，計算總糖含量(表3)。結果表明，果肉的總糖含量是種子的3倍。

圖3 紫外-可見分光光度計光譜掃描結果Fig.3 Visible absorption spectrum of Schisandrae chinensis Fructus extract

表3 果肉、種子和果實中總糖的含量測定結果Table 3 Total sugar contents in fresh, seed and whole fruit of Schisandrae chinensis Fructus

2.4 果肉中不同組分糖含量比較

精密稱定醇溶組分、醇沉組分和多糖組分各1.0mg，定容25mL量瓶中，配制成40mg/L待測溶液。照1.2.3.3節標準曲線的方法測定其吸光度，結合得膏率，計算每克果肉各組分糖的含量，結果見表4。

表4 果肉不同組分糖的含量測定結果Table 4 Polysaccharide contents in different fractions from Schisandrae chinensis Fructus flesh

2.5 果肉各組分單糖組成分析

圖4 五味子果肉的糖水解物及標準品的薄層色譜圖Fig.4 HPTLC profile of sugar standards, hydrolyzed alcohol-soluble fraction and hydrolyzed purified polysaccharide fraction from Schisandrae chinensis Fructus flesh

將五味子果肉醇溶組分(A)、精制后多糖(B)酸水解后，與葡萄糖、木糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、乳糖、蔗糖對照品，同板點樣，分析其單糖組成(圖4)。結果表明，果肉醇溶組分主要是葡萄糖(S1)，多糖組分主要是葡萄糖(S1)和半乳糖(S7)。

3 討論與結論

本研究結果表明，北五味子木脂素類成分主要在其種子中，糖類成分主要在其果肉中。將果肉提取物分為醇沉組分(粗多糖等)、醇溶組分(單糖、低聚糖等)及精制多糖，果肉中單糖、低聚糖的含量高于多糖。采用三氟乙酸水解處理發現，果肉中醇溶組分主要是葡萄糖，果肉中多糖組成主要是葡萄糖和半乳糖。提示開發利用五味子的不同成分，選用不同的藥用部位，可提高利用率，減少浪費[9]。

高效薄層色譜法能同時完成多個樣品的薄層色譜圖比較，尤其適用于藥材、食品中復雜天然產物的組分分離及定性、定量分析[10]。通過色譜圖譜可直觀將各樣品的相似程度和差異展示在同一張圖像中，從圖1、2和表2可以比較出五味子木脂素類成分主要在種子。圖4的單糖組成比較，果肉醇溶組分主要是葡萄糖；多糖組分主要是葡萄糖和半乳糖。本實驗選用的北五味子采用藥典中的高效液相色譜法檢測五味子醇甲含量為1.47%[11]，因提取和檢測方法不同，結果有一定差別。

本實驗采用Sevag法除蛋白和2mol/L三氟乙酸水解，李巧云等[12]認為，酶法與Sevag聯用法用于五味子粗多糖脫蛋白效果很好。孟憲軍等[13]在五味子多糖的分離純化中，采用酶法與三氯乙酸-正丁醇法結合脫蛋白。孫元琳等[14]報道不同程度酸水解和酶水解所得水解產物不一樣。

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Comparative Analysis of Bioactive Component in Seeds and Flesh ofSchisandrae chinensisFructusby Thin Layer Chromatography

LI Li-shun，SHI Wei-jing*，MA Xun-bing
(School of Food and Drug, Anhui Science and Technology University, Fengyang 233100, China)

Objective: To comparatively analyze bioactive components in seeds and flesh ofSchisandrae chinensisFructus.Methods: The contents of lignan in seeds, flesh and whole fruit ofSchisandrae chinensis Fructuswere determined by high performance thin layer chromatography (HPTLC). Sulfuric acid-phenol method was used to quantify sugar. After trifluoroacetic acid hydrolysis, the monosaccharide composition of the flesh was analyzed by HPTLC. Results: Lignans inSchisandrae chinensis Fructuswere mainly present in the seeds, and total sugar content was 169.34 mg/g in the flesh and 5.366 mg/g in the seeds. The alcoholsoluble, alcohol-insoluble and polysaccharide components were 117.06, 75.67 mg/g and 12.37 mg/g in the fresh, respectively. The alcohol-soluble fraction was mainly composed of glucose. The polysaccharide fraction was mainly composed of glucose and galactose.Conclusion: Bioactive components reveal a significant difference between seeds and flesh ofSchisandrae chinensis Fructus.

Schisandrae chinensisFructus；seeds；flesh；lignanoid；polysaccharides

R284.2；R931.6

A

1002-6630(2012)16-0175-04

2011-07-28

安徽省科技廳科技攻關重點項目(07010300153)；安徽省中藥材產業技術研發中心基金項目(ZYC20101503)；安徽科技學院自然科學研究計劃項目(ZRC2011294)

李立順(1957—)，男，副教授，主要從事中藥活性成分及復方應用研究。E-mail：lls3212@163.com

*通信作者：時維靜(1957—)，女，教授，主要從事中藥活性成分分離與檢測研究。E-mail：shiwj80@yahoo.com.cn