頂空-固相微萃取-氣相色譜串聯質譜法測定葡萄酒中多種氯酚及氯代茴香醚

陳樹兵，孟 原，施 瑛，倪梅林，莫燕霞，賀小雨

(1.寧波出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江 寧波 315012；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；3.南京農業大學理學院，江蘇 南京 225001)

頂空-固相微萃取-氣相色譜串聯質譜法測定葡萄酒中多種氯酚及氯代茴香醚

陳樹兵1，孟 原2，施 瑛3，倪梅林1，莫燕霞1，賀小雨1

(1.寧波出入境檢驗檢疫局技術中心，浙江 寧波 315012；2.寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211；3.南京農業大學理學院，江蘇 南京 225001)

樣品中氯酚經乙?；梢阴Ｂ确雍?，通過優化萃取頭、離子強度、溫度、時間等固相微萃取條件后，建立頂空-固相微萃取-氣相色譜串聯質譜法同時測定測定葡萄酒中的3種氯酚2,4,6-三氯酚(TCP)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP)、五氯酚(PCP)以及兩種氯代茴香醚2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)、五氯苯甲醚(PCA)含量的方法。結果表明：該方法檢出限為0.1ng/L，回收率為86.0%～105.9%，相對標準偏差小于16.5%。該方法前處理簡單、高效、檢測靈敏度高，可應用于進出口葡萄酒中木塞污染物的監控。

氯代茴香醚；氯酚；頂空-固相微萃取；氣相色譜串聯質譜；葡萄酒

葡萄酒在釀制、存放過程中出現霉味、泥土味主要是由于酒中含有2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)、2,3,4,6-四氯苯甲醚(TeCA)、五氯苯甲醚(PCA)等被稱作木塞污染物的氯代茴香醚類化合物[1-3]，其中以TCA在酒中的嗅覺閾值最低，有報道稱葡萄酒中TCA含量達到10ng/L就會影響到風味和品質，因而對酒的品質影響最大。目前，已有相關文獻報道通過液液萃取、固相萃取、固相微萃取等的前處理后，采用氣相色譜、氣相色譜-離子阱質譜聯用儀等測定葡萄酒的TCA等氯代茴香醚[4-8]。另外，有研究表明葡萄酒生產過程中可能遷移進入酒中或木塞中的一些氯酚如2,4,6-三氯酚(TCP)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP)以及五氯酚(PCP)等在葡萄酒的存放過程中由于普通微生物的作用也可以轉化為氯代茴香醚類化合物[9-10]，從而影響葡萄酒品質。因此，在分析葡萄酒中木塞污染物時，除了應考慮檢測直接對酒類風味產生影響的氯代茴香醚類物質，也應該檢測可以轉化為木塞污染物的氯酚類物質。

頂空進樣法是目前測定揮發性化合物的常用手段，而頂空-固相微萃取法前處理具有前處理方法簡單，操作簡便，靈敏度高等特點[11-12]。由于氯酚類物質極性較強，不易從酒中揮發，因此本研究通過在線衍生乙?；确雍骩13-14]，建立頂空固相微萃取-氣相色譜串聯質譜(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-tandem quadrupole mass sectrometry，HS-SPMEGC/MS/MS)同時測定葡萄酒中痕量氯酚及氯苯甲醚的分析方法，并應用該方法檢測部分進口葡萄酒樣品，旨在為進出口葡萄酒中氯代茴香醚及氯酚含量的監控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

葡萄酒 進口。

2,4,6-三氯苯甲醚(TCA，純度不低于99%)、五氯苯甲醚(PCA，純度不低于99%)、2,4,6-三氯酚(TCP，純度不低于99%)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP，純度不低于99%)、五氯酚(PCP，純度不低于99%) 德國Dr.Ehrenstorfer公司；乙酸酐(分析純) 美國Sigma公司；無水K2CO3、氯化鈉(分析純) 國藥集團化學試劑有限公司；甲醇(分析純) 美國Dima公司；萃取頭PDMS(100μm) 美國Supelco公司。

7000B氣相色譜-串聯質譜(配備電子電離源)、HP-5色譜柱(30.0m×0.25mm，0.25μm) 美國Agilent公司。

1.2 溶液的配制

標準儲備液的配制：精確稱取TCP、TeCP、PCP以及TCA、PCA各10mg溶于10mL甲醇中，配制成質量濃度為1mg/mL的標準溶液。準確吸取上述各標準儲備液1mL于100mL容量瓶中，用甲醇定容至100mL，配制成10μg/mL的混合標準溶液，搖勻置于4℃冰箱儲存備用。

5g/100mL K2CO3溶液：準確稱取12.5g無水碳酸鉀置于燒杯中，加水攪拌溶解后轉移到容量瓶(250mL)中，定容至250mL。

1.3 色譜和質譜條件

色譜條件：HP-5色譜柱(30.0m×0.25mm，0.25μm)；初始柱溫50℃保持1min，以20℃/min升至115℃，然后以5℃/min升至200℃，再以30℃/min升至250℃。載氣為He氣，恒流模式，流速1.2mL/min，氣化室溫度250℃，不分流進樣。

質譜條件：電子電離源(electron ionization，EI)模式、離子源溫度300℃、電子能量70eV、傳輸線溫度250℃、溶劑延遲時間4.5min。5種目標化合物的測定參數如表1所示。

表1 乙?；确雍吐缺郊酌驯Ａ魰r間及MS/MS條件參數Table 1 Retention time and MS-MS detection parameters for acetylchlorophenols and chloroanisols

1.4 固相微萃取條件

準確移取5mL酒樣于15mL頂空進樣瓶中，加入3g NaCl、2mL 5g/100mL K2CO3溶液、200μL乙酸酐，用帶隔墊的鋁蓋封口，振蕩1min之后，靜置衍生20min。預平衡溫度和萃取溫度為70℃，預平衡時間15min、萃取時間20min、恒溫振蕩槽中預平衡時振動速率150r/min、萃取時振動速率150r/min。完成萃取過程后，本實驗采用手動進樣，減少萃取裝置在空中的暴露時間，迅速進樣，熱脫附時間為5min。

2 結果與分析

目前，氯代茴香醚類物質已有文獻報道采用固相微萃取技術作為前處理手段吸附、富集并結合氣相色譜、氣相色譜-質譜聯用儀進行分析[4-8]，而氯酚類物質極性較強，揮發性差，不能直接采用氣相色譜進行分析，因此本研究采用分析酚類物質時常用的乙酰化衍生法[14-16]，在酒樣中直接加入乙酸酐作為乙?；苌噭?，在堿性條件下生成乙酰氯酚類物質，并討論了萃取頭類型、樣品溶液的離子強度、萃取溫度、萃取時間等影響乙酰氯酚及氯代茴香醚萃取效率的主要因素。

2.1 萃取頭的選擇

萃取頭的選擇主要要考慮兩點，一方面是根據待分析物的極性。萃取頭的固定相涂層有極性涂層，如聚丙烯酸酯(PA)、聚乙二醇(CW)，適于極性化合物；非極性涂層，如聚二甲基硅氧烷(PDMS)，適于非極性和弱極性化合物；中等極性混合型涂層，包括聚乙二醇聚二乙烯基苯(CW-DVB)、羧乙基-聚二乙烯基苯(CARDVB)、羧乙基-聚二乙烯基苯-聚二甲基硅氧烷(CARDVB-PDMS)等；另一方面是涂層厚度對分析物的固相吸附量和平衡時間都有影響，涂層越厚，固相吸附量越大，靈敏度亦越高；但涂層越厚，達到分析平均的時間越長，解析平衡時間也越長，分析速度慢，因此應綜合以上因素選擇合適的涂層厚度。總的看來，涂層厚度對分析靈敏度影響較大，對分析速度影響較小。通過比較聚二甲基硅氧烷(PDMS，100μm)，聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯(PDMS-DVB，65μm)，聚丙烯酸酯(PA，85μm)，聚二甲基硅氧烷-羧乙基(PDMSCAR，75μm)及二乙烯基苯-羧乙基-聚二甲基硅氧烷(DVB-CAR-PDMS，50/30μm)的頂空萃取效果后，發現100μm PDMS萃取頭的萃取效果最好。

2.2 離子強度的影響

圖1 離子強度對各分析物(200μg/L)響應值的影響Fig.1 Effect of ionic strength on response value of analytes

適當增加溶液中的離子濃度可以減少被分析物在溶液中的可溶性，能使更多的揮發性物質揮發至溶液的頂空，吸附到纖維頭，從而降低方法的檢測限。離子強度的影響通過加入NaCl的量進行研究。NaCl的加入提高了分析物的氣液分配系數，這樣可以使分析物的溶解性下降，提高萃取效率。實驗研究加入0.5～4g NaCl后的萃取效果，如圖1所示，當NaCl加入3g時各種分析物均達到較好的萃取效果。

2.3 萃取溫度的影響

圖2 萃取溫度對于各分析物(50ng/L)響應值的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on response values of five analytes

由圖2可見，分析物回收率受溫度選擇的影響，響應值有所波動，溫度上升對于TCA的萃取影響較小，而對于其他4種分析物，溫度升高萃取效果顯著，溫度上升70℃可以讓各萃取物達到最佳效果，溫度高于70℃萃取量的趨于穩定或者有所下降。因此，70℃被確定為最佳萃取溫度。

2.4 萃取時間的影響

圖4 萃取時間對各分析物(50ng/L)響應值的影響Table 4 Effect of extraction time on response values of five analytes

由圖4可見，從各分析物萃取時間來看，在10～20min萃取效果呈遞增趨勢，而到20min之后趨于平緩。因此，20min的萃取時間選擇為最佳萃取時間。

2.5 標準曲線及方法的檢出限

以新開的葡萄酒為樣品，分別添加2,4,6-三氯酚(TCP)、2,3,4,6-四氯酚(TeCP)、五氯酚(PCP)以及2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)、五氯苯甲醚(PCA)1μg/L的混合標準溶液20、50、100、250、500μL，按照1.4節條件萃取并進樣分析，以樣品峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，并確定檢出限(RSN＝3)見表2。

表2 木塞污染物的線性方程及檢測限Table 2 Linear equations and detection limits for cork pollutants

2.6 樣品回收率與精密度測定

表3 葡萄酒樣品中木塞污染物的加標分析(n=5)Table 3 Recovery rates and RSDs for cork pollutants in spiked wine

選取陰性葡萄酒樣品，分別添加了10、20、50ng/L 3個添加量的5種木塞污染物，考察了回收率及精密度。如表3所示，5種木塞污染物的回收率86.0%～105.9%，相對標準偏差小于16.5%。結果表明，本研究建立的頂空固相微萃取-氣相色譜串聯質譜檢測方法具有較高的準確性，可以滿足葡萄酒樣品中木塞污染物的監控要求。加標樣品的MRM模式質譜圖見圖5。

圖5 樣品加標MRM模式總離子流圖(100ng/L)Fig.5 Total ion current chromatogram of spiked positive sample

2.7 實際葡萄酒樣品檢測

采用該檢測方法對不同類型的進口葡萄酒(干紅、干白、起泡酒、發酵酒和甜紅等)共計84個樣品進行檢測，其中TCA檢出率為15.5%，但含量均低于嗅覺閾值10ng/L；TCP檢出率為100%，含量在2.13～369.43ng/L之間；TeCP檢出率為83.3%，檢測出的最高含量為21.44ng/L；PCA的檢出率為33.3%，但含量均很低，遠低于其在水中的嗅覺閾值4000ng/L[9]；PCP的檢出率為33.3%，最高檢出量為32.12ng/L。

3 結 論

本研究通過在線衍生氯酚后，采用頂空-固相微萃取-氣相色譜串聯質譜法檢測了葡萄酒中多種氯酚、氯苯甲醚等木塞污染物。對100μm PDMS萃取頭的萃取條件進行優化：5mL酒樣中加入200μL乙酸酐常溫衍生20min，加入3g NaCl，在振蕩萃取條件下，萃取時間20min、萃取溫度70℃，方法靈敏度高，回收率為86.0%～105.9%，RSD小于16.5%，建立的木塞污染物檢測方法可以滿足日常進出口葡萄酒中氯酚、氯苯甲醚等木塞污染物的監控要求。

[1] 房玉林, 孟江飛, 張昂, 等. 葡萄酒及軟木塞中TCA的檢測分析方法研究現狀及應用前景[J]. 食品科學, 2009, 30(21): 469-475.

[2] MAZZOLENI V, MAGGI L. Effect of wine style on the perception of 2,4,6-trichloroanisole, a compound related to cork taint in wine[J]. Food Research International, 2007, 40(6): 694-699.

[3] PRESCOTT J, NORRIS L, KUNST M, et al. Estimating a “consumer rejection threshold” for cork taint in white wine[J]. Food Quality and Preference, 2005, 16(4): 345-349.

[4] EVANS T J, BUTZKE C E, EBELER S E. Analysis of 2,4,6-trichloroanisole in wines using solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 1997, 786(2): 293-298.

[5] RIU M, MESTRES M, BUSTO O, et al. Determination of 2,4,6-trichloroanisole in wines by headspace solidphase microextraction and gas chromatography-electron-capture detection[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 977(1): 1-8.

[6] 衛曉紅, 李燕, 張燕, 等. 固相微萃取-氣相色譜法測定葡萄酒及軟木塞中2,4,6-三氯苯甲醚(TCA)[J]. 釀酒科技, 2010, 190(4): 92-95.[7] 鄧曉軍, 郭德華, 李波, 等. 葡萄酒中痕量木塞污染物的頂空固相微萃取-氣相色譜串聯質譜法檢測[J]. 分析測試學報, 2008, 27(12):l375-1378.

[8] JONSSON S, UUSITALO T, BAVEL B V, et al. Determination of 2,4,6-trichloroanisole and 2,4,6-tribromoanisole on ng L-1to pg L-1levels in wine by solid-phase microextraction and gas chromatography-high-resolution mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2006, 1111(1): 71-75.

[9] MARTINEZ-URUUELA A, RODRGUEZ I, CELA R, et a1. Development of a solid-phase extraction method for the simultaneous determination of chloroanisoles and chlorophenols in red wine using gas chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Analytica Chimica Acta, 2005,549(1/2): 117-123.

[10] 孫雪梅. 軟木塞的特性及其在葡萄酒生產中的應用[J]. 葡萄栽培與釀酒, 1998(2): 32-33.

[11] 張岱, 王方, 王偉, 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用技術比較赤霞珠干化葡萄和干化葡萄酒香氣成分[J]. 食品與發酵工業, 2010,36(2): 168-171.

[12] 羅煊, 李德美, 于靜, 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法分析葡萄酒中風味物質[J]. 食品與發酵工業, 2009, 35(7): 128-132.

[14] LLOMPART M, LOURIDO M, LANDP, et al. Optimization of a derivatization-solid-phase microextraction method for the analysis of thirty phenolic pollutants in water samples[J]. Journal of Chromatography A, 2002, 963(1): 137-148.

Determination of Chlorophenols and Chloroanisols in Wine by Headspace Solid-Phase Microextraction and Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Shu-bing1，MENG Yuan2，SHI Ying3，NI Mei-lin1，MO Yan-xia1，HE Xiao-yu1
(1. Technology Center, Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Ningbo 315012, China；2. Faculty of Maritime,Ningbo University, Ningbo 315211, China；3. College of Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 225001, China)

A headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-tandem mass spectrometric (HS-SPME- GCMS/MS) method was proposed for the simultaneous determination of three chlorophenols 2,4,6-trichlorophenol (TCP), 2,3,4,6-tetrachlorophenol (TeCP), pentachlorophenol (PCP) and two chloroanisols including pentachloroanisol (PCA) and 2,4,6-trichloroanisol (TCA) in wine. Chlorophenols from wine samples were acetylated and then analyzed by GC-MS/MS in a multireaction monitoring (MRM) mode. Four extraction parameters including extraction fiber, ion strength, extraction temperature and extraction time were optimized. The results showed that the limit of detection of this method was 0.1 ng/L. The average spike recovery rates of five analytes in a positive sample were 86.0%－105.9% with a RSD less than 16.5% (n= 5). This method was simple, effective, sensitive and therefore applicable to monitor cork taint in exported and imported wine.

chlorophenols；chloroanisols；HS-SPME；GC-MS/MS；wine

TS207.3；O657

A

1002-6630(2012)16-0146-04

2011-10-12

項目支持：國家質檢總局科技計劃項目(2009IK172)

陳樹兵(1980—)，男，工程師，碩士，研究方向食品安全與食品污染物分析。E-mail：chensb@nbciq.gov.cn