食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增快速檢測方法的建立

徐義剛，崔麗春，李丹丹，劉忠梅，李蘇龍，張子群，張國財,*

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；3.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，海南 海口 570125)

食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增快速檢測方法的建立

徐義剛1，崔麗春2，李丹丹3，劉忠梅1，李蘇龍1，張子群1，張國財2,*

(1.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱150040；3.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?570125)

基于單核細(xì)胞增生李斯特菌胞壁質(zhì)水解酶iap基因，設(shè)計兩對特異性引物，利用DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增(loopmediated isothermal amplification，LAMP)技術(shù)，以擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂實時濁度為判定標(biāo)準(zhǔn)，建立食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP快速檢測方法。結(jié)果顯示，本LAMP方法特異性強，經(jīng)過對29株細(xì)菌進(jìn)行檢測，所試單核細(xì)胞增生李斯特菌均為LAMP陽性，其他菌株為陰性；本LAMP方法對單核細(xì)胞增生李斯特菌純培養(yǎng)菌的檢測靈敏度為8CFU/管，對污染食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測靈敏度為12CFU/管。本研究建立的LAMP檢測方法簡便快速、結(jié)果判斷直觀。

單核細(xì)胞增生李斯特菌；iap基因；環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增；快速檢測

李斯特菌屬(Listeria)有2個群共7個種，第1群包括單核細(xì)胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)、綿羊李斯特菌(L. ivanovii)、英諾克李斯特菌(L. innocua)、威爾斯李斯特菌(L. welshimei)、西爾李斯特菌(L. seeligeri)；第2群為較少見的格氏李斯特菌(L. grayi)和莫氏李斯特菌(L. murrayi)[1]。其中，單核細(xì)胞增生李斯特菌是唯一能引起人類疾病的一種重要的人畜共患病和食源性疾病的致病菌，在自然界中廣泛存在。人類主要食入被污染的食品而感染，主要引起以敗血癥、腦膜炎、流產(chǎn)和單核細(xì)胞增多為特征的臨床癥狀[2]，嚴(yán)重危害食品安全和人類健康。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)指出，目前包括蔬菜、奶及奶制品、肉制品在內(nèi)的消費性食品均不同程度的受到單核細(xì)胞增生李斯特菌污染，該菌種是我國進(jìn)出口食品主要法檢致病菌之一。因此，建立快速、準(zhǔn)確的檢測方法對防控單核細(xì)胞增生李斯特菌，增強食品安全具有重要意義。目前，針對食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測仍以傳統(tǒng)方法為主[3]，即先進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)，然后對可疑菌落進(jìn)行系列生化反應(yīng)、動力、溶血及毒力實驗，完成鑒定工作一般需要7～10d，嚴(yán)重影響檢測鑒定的速度。全自動免疫熒光檢測方法[4]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法[5]、顯色培養(yǎng)基快速檢測方法[6]和脈沖場凝膠電泳技術(shù)[7]的應(yīng)用促進(jìn)了單核細(xì)胞增生李斯特菌檢測技術(shù)的發(fā)展，但存在一定的局限性。顯色培養(yǎng)基檢測方法雖然檢測快速，但特異性和靈敏度差，在檢測中，易造成漏檢；PCR方法具備敏感性高及特異性強等優(yōu)點，但核酸染料對人體健康和環(huán)境存在巨大安全隱患；全自動免疫熒光檢測方法和脈沖場凝膠電泳技術(shù)對實驗條件要求比較高，需要昂貴的儀器設(shè)備和專業(yè)人員，且操作相對復(fù)雜、檢測成本高，基層單位難以開展。

更快捷、更精確、更靈敏、操作更簡便的檢測方法一直是致病微生物檢測技術(shù)的發(fā)展方向。環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新穎的核酸恒溫擴增方法，其原理是針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計4條特異引物，利用鏈置換DNA聚合酶在恒溫60～65℃條件下，40～60min即可完成核酸擴增，直接通過擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀的濁度判斷是否發(fā)生反應(yīng)[8-10]。LAMP方法操作簡便、檢測快速、靈敏度高且成本低廉，便于推廣使用，該項技術(shù)已在疾病診斷、病原檢測等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[11-18]。本研究擬利用該項技術(shù)建立單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP快速檢測方法。

特異性靶基因的選擇是建立LAMP檢測方法的關(guān)鍵。p60蛋白是李斯特菌產(chǎn)生的一種胞外蛋白，由iap基因編碼，具有胞壁質(zhì)水解酶活性，與吞噬細(xì)胞溶解作用及其對機體的侵襲性密切相關(guān)[19]。李斯特菌屬中的7個菌種均能夠產(chǎn)生p60蛋白，編碼p60蛋白N端和C端的基因片段高度保守，而不同種李斯特菌p60蛋白的中間區(qū)域各具特異性，利用此特異性可將單核細(xì)胞增生李斯特菌與其余6個種區(qū)分開來[20]。因此，本研究選擇iap基因作為檢測靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

實驗所用菌株分別來自中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏管理中心和美國典型菌種保藏中心，單核細(xì)胞增生李斯特菌分離株由本中心分離保存(表1)。

表1 菌株及LAMP方法特異性檢測結(jié)果Table 1 Bacterial strains used in this study and the specificity of LAMP assay

BstDNA Polymerase 美國 New England Biolabs公司；TaqDNA Polymerase、甜菜堿 美國Sigma公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司。

LA-320c LAMP實時濁度儀 濟南貝林生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 LAMP引物設(shè)計

將單核細(xì)胞增生李斯特菌iap基因在Genbank上進(jìn)行BLAST比對，選定同源性好的區(qū)域，通過Seqman軟件分析，確定iap基因高度保守序列，并以此作為靶序列。將選定序列輸入軟件PrimerExplorer V3，通過調(diào)整3′端dG和Dimer dG參數(shù)，優(yōu)化出LAMP引物，包括兩條外引物F3和B3及兩條內(nèi)引物FIP和BIP(表2)。引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

表2 LAMP引物及序列Table 2 Primer sequences for LAMP used in this study

1.2.2 細(xì)菌基因組DNA的提取

試劑盒提取法提取細(xì)菌基因組DNA(主要用于LAMP方法的建立和靈敏度實驗)，具體操作步驟詳見試劑盒說明書。煮沸法提取細(xì)菌DNA(主要用于LAMP方法的特異性實驗)：取1mL過夜培養(yǎng)菌液，10000r/min離心5min，棄去上清液，加入100μL含0.5% SDS的無菌水，充分懸浮菌體，100℃水浴10min，10000r/min離心5min，上清液于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 LAMP方法的建立

50μL反應(yīng)體系中，含10×ThermoPoL Buffer 5μL(200mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl、20mmol/L MgSO4、100mmol/L (NH4)2SO4、1.0% Tritonx-100)、2.5mmol/L dNTP 8μL、100mmol/L MgSO44μL、40mmol/L FIP 1μL、40mmol/L BIP 1μL、10mmol/L F3 1μL、10mmol/L B3 1μL、10mmol/L 甜菜堿 4μL、5U/μLTaqDNA Polymerase 2μL、8U/μLBstDNA Polymerase 2μL、單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA模板1μL，去離子水20μL。反應(yīng)管置于LAMP濁度儀內(nèi)，反應(yīng)溫度65℃，時間60min，設(shè)定對樣品的濁度進(jìn)行測定頻率為1次/min，反應(yīng)結(jié)束后，同時利用瓊脂糖凝膠電泳驗證是否發(fā)生LAMP反應(yīng)。

1.2.4 LAMP靈敏度試驗

將菌體濃度相當(dāng)于8.3×107CFU/mL的單核細(xì)胞增生李斯特菌(ATCC 19111)進(jìn)行10倍梯度稀釋，使用試劑盒法提取每個稀釋度細(xì)菌基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行LAMP擴增，觀察每組樣品的實時濁度變化，確定檢測靈敏度。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)電泳檢測，驗證其檢測靈敏度。

1.2.5 LAMP特異性試驗

利用建立的LAMP方法對表1中的病原菌進(jìn)行檢測，驗證該方法的特異性。

1.2.6 污染食品中致病菌檢測靈敏度試驗

取10g經(jīng)傳統(tǒng)檢測方法未檢出單核細(xì)胞增生李斯特菌的新鮮雞肉樣品，加入90mL堿性蛋白胨水，制成勻漿；加入1mL菌體濃度約為1.2×108CFU/mL的單核細(xì)胞增生李斯特菌，充分混勻；取1g(約1mL)勻漿(含細(xì)菌濃度約為1.2×106CFU/g)進(jìn)行10倍梯度稀釋；每個稀釋梯度分別取1g(約1mL)，10000r/min離心5min，棄上清液，試劑盒提取DNA，進(jìn)行LAMP擴增，觀察每組樣品的實時濁度變化，確定檢測靈敏度。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)電泳檢測，驗證其檢測靈敏度。

1.2.7 驗證實驗

將建立的單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP快速檢測方法應(yīng)用于檢驗檢疫實踐工作中，以我國現(xiàn)行的單核細(xì)胞增生李斯特菌國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法(GB/T 4789. 30—2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗：單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗》)作為參考方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP方法的建立

選擇單核細(xì)胞增生李斯特菌iap基因特異性區(qū)域設(shè)計兩對LAMP引物，以試劑盒提取的單核細(xì)胞增生李斯特菌基因組DNA為模板，在BstDNA Polymerase作用下，65℃環(huán)境溫度進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖1所示。隨著反應(yīng)的進(jìn)行，核酸陽性反應(yīng)管中溶液的濁度值逐漸升高，說明發(fā)生了LAMP反應(yīng)，其擴增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的含量在逐漸增多，而陰性對照反應(yīng)管溶液未變渾濁，沒有發(fā)生LAMP反應(yīng)；瓊脂糖凝膠電泳驗證結(jié)果顯示，陽性反應(yīng)管中發(fā)生LAMP擴增反應(yīng)，出現(xiàn)典型的LAMP擴增泳帶，而陰性對照未發(fā)生反應(yīng)。結(jié)果說明，本研究建立的單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP檢測方法可行。

圖1 單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP檢測方法的建立Fig. 1 Development of LAMP method for the detection of L. monocytogenes

2.2 LAMP靈敏度實驗結(jié)果

將菌體濃度相當(dāng)于8.3×107CFU/mL的單核細(xì)胞增生李斯特菌(ATCC 19111)10倍梯度稀釋，以每個稀釋度提取的基因組DNA作為模板，進(jìn)行LAMP擴增，結(jié)果如圖2所示。結(jié)合每組反應(yīng)管中溶液的實時濁度值和瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果可知，該LAMP方法的檢測靈敏度為8CFU/反應(yīng)管。

圖2 單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP方法靈敏度的確定Fig.2 Determination of the sensitivity of LAMP method for L. monocytogenes

2.3 污染食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP檢測靈敏度

將含有單核細(xì)胞增生李斯特菌菌體濃度相當(dāng)于1.2×106CFU/g的雞肉勻漿液進(jìn)行10倍梯度稀釋，以每個稀釋度提取的基因組DNA作為模板，進(jìn)行LAMP擴增，結(jié)果如圖3所示。從每組反應(yīng)管中溶液的實時濁度值可知，樣品經(jīng)105倍稀釋后，LAMP擴增仍能有效進(jìn)行，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，證實該LAMP方法針對污染食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測靈敏度為12CFU/反應(yīng)管。

圖3 污染食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP方法靈敏度的確定Fig.3 Sensitivity of LAMP method for L. monocytogenes in contaminated foods

2.4 LAMP特異性實驗

利用建立的單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP方法對表1中的29株細(xì)菌進(jìn)行檢測，結(jié)果表明：所試5株單核細(xì)胞增生李斯特菌均為LAMP陽性，而包括李斯特菌屬其他菌株在內(nèi)的27株細(xì)菌為陰性結(jié)果，說明本LAMP方法具有高度特異性。

2.5 驗證實驗

2010年1月至2011年3月期間，采用該LAMP方法對738份進(jìn)出口食品樣品、市場流通食品樣品和人工污染食品樣品進(jìn)行了檢測，結(jié)果見表3。其中，共檢出23份單核細(xì)胞增生李斯特菌陽性樣品，經(jīng)國標(biāo)法(GB/T 4789.30—2008)復(fù)檢，兩者檢測結(jié)果符合率為100%，顯示該LAMP方法具有良好的可靠性。

表3 LAMP方法實踐檢測Table 3 Practical applications of LAMP method

3 結(jié) 論

本研究建立的單核細(xì)胞增生李斯特菌LAMP快速檢測方法操作簡便、特異性強、靈敏度高，對單核細(xì)胞增生李斯特菌純培養(yǎng)菌的檢測靈敏度為8CFU/反應(yīng)管，對污染食品中單核細(xì)胞增生李斯特菌的檢測靈敏度為12CFU/反應(yīng)管，60min內(nèi)即可完成檢測，達(dá)到快速檢測目的。實踐應(yīng)用證明，本LAMP方法檢測結(jié)果與國標(biāo)法檢測結(jié)果的符合率為100%，具有良好的實用性。

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Development of Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection ofListeria monocytogenesin Foods

XU Yi-gang1，CUI Li-chun2，LI Dan-dan3，LIU Zhong-mei1，LI Su-long1，ZHANG Zi-qun1，ZHANG Guo-cai2,*
(1. Technical Centre of Inspection and Quarantine, Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China；2. College of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China；3. Technical Centre of Inspection and Quarantine, Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Haikou 570125, China)

According to the iap gene ofListeria monocytogenes, two pairs of specific primers were designed, and then a rapid loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detectingListeria monocytogenesin foods was developed using realtime turbidity of the amplification byproduct magnesium pyrophosphate as the positive criterion. Twenty-nine bacterial strains were used to evaluate the specificity of the LAMP method. Our results showed that all testedListeria monocytogeneswere positive,while other strains were negative to LAMP detection, suggesting that this LAMP method was highly specific to the target bacteria. The sensitivity for cultivatedListeria monocytogenesand its contaminated foods were was 8 CFU and 12 CFU per test tube, respectively. The LAMP method developed in this study provides a sensitive, rapid and simple approach for the detection ofListeria monocytogenes.

Listeria monocytogenes；iapgene；LAMP；rapid detection

R155.5

A

1002-6630(2012)16-0137-05

2011-07-06

國家質(zhì)檢總局科技計劃項目(2008IK162)；黑龍江省博士后基金項目(LBH-Z09)

徐義剛(1978—)，男，高級獸醫(yī)師，博士后，研究方向為病原微生物防治與快速診斷技術(shù)。E-mail：yigangxu_china@yahoo.com.cn

*通信作者：張國財(1964—)，男，教授，博士，研究方向為生物防治技術(shù)。E-mail：zhang640308@126.com