酶法提取雞蛋殼膜膠原蛋白工藝

任 萌，宮新統，趙頌寧，張元元，孫研博，殷建偉，劉靜波*

(吉林大學軍需科技學院營養與功能食品研究室，吉林 長春 130062)

酶法提取雞蛋殼膜膠原蛋白工藝

任 萌，宮新統，趙頌寧，張元元，孫研博，殷建偉，劉靜波*

(吉林大學軍需科技學院營養與功能食品研究室，吉林 長春 130062)

采用酶解法從雞蛋膜中提取膠原蛋白，研究酶的種類、pH值、酶用量、料水比和提取時間對膠原蛋白提取的影響，采用單因素試驗并結合L9(34)正交試驗優化，得出酶法提取蛋殼膜中的膠原蛋白的最佳工藝條件為常溫條件下質量分數6%木瓜蛋白酶在pH5、料水比1:100(g/mL)條件下、酶解5h，膠原蛋白的提取率達到0.91%。得到高效提取膠原蛋白的工藝，不僅解決了廢棄雞蛋殼膜的環境污染問題，而且在膠原蛋白生產工業有較大的實際利用價值。

蛋殼膜；膠原蛋白；酶法；提取

我國是禽蛋生產大國，禽蛋消費巨大隨之也帶來了蛋殼廢棄物的增多，蛋清液、蛋殼膜腐敗造成一定程度的環境污染。在提倡節能環保的今天，垃圾的資源化、減量化具有重要意義。

蛋殼占整蛋質量10%～12%[1]。廢棄的蛋殼由蛋殼與蛋殼內膜組成。蛋殼中含有豐富的鈣質，國內有利用蛋殼制成檸檬酸-蘋果酸復合鈣[2-4]的工藝研究，這類研究對蛋殼進行有效利用，可以減少資源浪費。與蛋殼相比，蛋殼膜具有更廣泛的生物活性，其主要成分是蛋白質，類似細胞膜蛋白質的組成，以糖蛋白的形式存在[5]。殼膜約含有90%蛋白質、3%脂質體和2%糖類。其中，蛋白質有角蛋白、膠原蛋白、復合蛋白等[6]。殼膜中約含有其自重10%的膠原蛋白，然而成功從蛋膜中提取純的膠原蛋白尚未見文獻報道[7]。

膠原蛋白是具有極高生理活性的蛋白質，也是生物科技產業關鍵性的原材料之一，廣泛的應用于各個領域中[8]，因而提取膠原蛋白的原料也成為動物研究熱點[9]。當今工業膠原蛋白的提取原料多為小腿皮膚和骨骼[10]，若把蛋殼中的膠原蛋白提取出來將是對資源具有創新性的再利用。有研究表明，蛋殼膜膠原蛋白可以作為潛在的資源代替哺乳動物膠原的商業應用[11]，從而降低了原料風險，已經證實，蛋殼膜的自身免疫和過敏反應很低[12]。綜上所述：蛋殼膜應用于功能食品、化妝品和其他工業的可能性很大。隨著膠原蛋白產品的暢銷以及人們越來越重視其營養功能，正因如此膠原蛋白在醫藥、食品等行業中應用較多[13-15]，膠原蛋白提取工藝也成為研究熱點，有熱水提取、堿法提取、酶提取[16]等，其中酶法提取最為廣泛[17-18]。本實驗利用酶解法從蛋殼膜中提取出膠原蛋白營養物質，使蛋殼膜成為提取膠原蛋白的創新可靠來源。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

廢棄蛋殼、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、羥脯氨酸標準品、檸檬酸緩沖液、氯胺T、高氯酸、對甲氨基苯甲醛。

紫外-可見分光光度計 日本島津公司；AG204型電子天平 瑞士Mettle Toledo公司；華克電子天平 福州華志科學儀器有限公司；101-3-S型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海躍進醫療器械廠；FN-200型高速萬能粉碎機北京中興偉業儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品預處理理及試劑配制

樣品預處理：將蛋殼清洗，手剝蛋殼，將得到的蛋殼膜干燥并粉碎成粉末，儲存備用。

試劑配制：配制pH 6檸檬酸緩沖液(分析純)，0.05mol/L氯胺T溶液(分析純)，3.15mol/L過氯酸溶液(分析純)，10%對二甲氨基苯甲醛溶液(分析純)，1mg/mL羥脯氨酸貯存液(標準品)，100μg/mL羥脯氨酸測定液(現用現配)。

1.2.2 分析方法(以羥脯氨酸計)[19]

羥脯氨酸與羥賴氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，在其他蛋白中少見[20]。所以可以通過測羥脯氨酸的含量間接計算膠原蛋白的含量。紫外可見分光光度法測定膠原蛋白含量，膠原蛋白提取率計算公式：

式中：c為羥脯氨酸的質量濃度/(μg/mL)；V為離心后上清液體積/mL；k為稀釋倍數；m為雞蛋殼膜質量/g；11.1為羥脯氨酸與膠原蛋白的換算系數。

1.2.3 單因素試驗設計

試驗中考察酶解酶種類、pH值、酶用量(質量分數)、料水比、時間對雞蛋殼膜中膠原蛋白提取的影響，單因素試驗水平因素見表1。

表1 單因素試驗設計與因素水平表Table 1 One-factor-at-a-time design scheme

1.2.4 L9(34)正交試驗設計

正交試驗中選取了對雞蛋殼膜中膠原蛋白提取影響較為顯著的酶種類、pH值、酶用量、時間4因素，正交試驗水平因素編碼見表2。

表2 酶法提取蛋殼膜膠原蛋白工藝優化正交試驗水平因素編碼表Table 2 Factors and their coded levels in orthogonal array design

2 結果與分析

2.1 膠原蛋白測定標準曲線

采用紫外-可見分光光度法測定羥脯氨酸的標準曲線如圖所示，其回歸方程為：y＝0.0575x＋0.1191，其相關系數R2＝0.9997，線性關系良好，因此可作為膠原蛋白含量測定的標準。

2.2 酶種類對膠原蛋白提取率的影響

取3份殼膜粉，分別加入質量分數6%的胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，反應溫度為室溫，料水比為1:100，酶解時間為4h，pH值條件為4、9.18、6.86(為各自最佳pH值條件)。酶解反應后過濾，得到膠原蛋白提取液，進行羥脯氨酸含量的測定，結果見圖1。

圖1 酶種類對膠原蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of enzyme type on extraction rate of collagen

由圖1可知，胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶的提取率逐漸降低，這說明胃蛋白酶的結構和成分更適合來水解作用于蛋殼膜粉，得到較高的提取率。

2.3 酶解pH值對膠原蛋白提取率的影響

取4份殼膜粉，分別加入6%胃蛋白酶，反應的溫度為室溫，p H值條件為1、2、3、4，料水比為1:100，酶解4h。酶解反應后過濾，得到膠原蛋白提取液，進行羥脯氨酸含量測定，結果見圖2。

圖2 酶解pH值對膠原蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis pH on extraction rate of collagen

由圖2可知，提取率隨著pH值的增大呈先上升后下降的趨勢，pH2時有最大的提取率。可能因為胃蛋白酶的最適pH接近2，在此環境下，酶的活性較好，水解蛋殼膜更徹底。

2.4 酶用量對膠原蛋白提取率的影響

取5份殼膜粉，分別加入質量分數4%、6%、8%、10%、12%的胃蛋白酶，在pH2、料水比1:100，酶解4h條件下進行酶解試驗。酶解反應結后過濾，得到膠原蛋白提取液，進行羥脯氨酸含量的測定，結果見圖3。

圖3 酶用量對膠原蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of enzyme dose on extraction rate of collagen

由圖3可知，提取率隨著酶用量的增加呈現先上升后下降的趨勢，在酶用量8%時達到最大。底物相同，隨著酶酶用量的增加，底物反應的更充分，超過8%后，提取率呈下降趨勢，可能由于酶用量偏大，多余的酶可能發生凝聚，致使提取率降低，在某種程度上抑制了水解反應的進行。

2.5 酶解料水比對膠原蛋白提取率的影響

圖4 酶解料水比對膠原蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of material-to-water ratio on extraction rate of collagen

取5份殼膜粉，分別加入8%胃蛋白酶、pH2、酶解4h，料水比分別為1:60、1:80、1:100、1:120、1:140。酶解反應后過濾，得到膠原蛋白提取液，進行羥脯氨酸含量的測定，結果見圖4。

由圖4可知，提取率隨著水的添加量的增加呈現先增加后下降的趨勢，且在料水比為1:100時達到最高峰，這可能是由于較高的料水比體系中，所殼膜粉不能與溶劑充分反應，而當反應體系中溶劑的量達到一定值時，殼膜粉可與整個反應體系充分接觸，促進膠原蛋白的生成，從而得到較高的提取率，而當水的添加量過高時，會較大地稀釋溶劑酸，故而導致膠原蛋白提取率的下降。

2.6 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響

取5份殼膜粉，分別加入8%胃蛋白酶，pH2，料水比1:100，酶解時間分別為1、2、3、4、5h。酶解反應后過濾，得到膠原蛋白提取液，進行羥脯氨酸含量的測定，結果見圖5。

圖5 酶解時間對膠原蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of hydrolysis time on extraction rate of collagen

由圖5可知，隨反應時間的延長呈現先增加后趨于平穩的趨勢。且當反應時間4h時達到最高值。隨著反應時間的增加，使得酶與底物更充分接觸反應，提取率逐漸增大。然而隨著反應時間進一步增加，酶與底物的反應趨于完全，提取率不再增加，趨于平穩。

2.7 酶法提取蛋殼膜膠原蛋白工藝優化正交試驗

表3 酶法提取蛋殼膜膠原蛋白工藝優化正交試驗設計與結果Table 3 Orthogonal array design arrangement and corresponding results

通過單因素試驗，在料水比1:100條件下通過正交試驗，考察酶解的酶種類、p H值、時間、酶用量4個單因素對雞蛋殼膜中膠原蛋白提取率的影響，結果見表3，通過正交試驗所得結果進行極差分析，可知因素影響順序為C＞D＞B＞A，即酶用量＞時間＞pH值＞酶種類。試驗最優方案為A1B2C1D3，即采用木瓜蛋白酶、pH4、酶用量6%、酶解時間5h條件為最優工藝路線，按優選工藝進行驗證實驗，3次平行試驗雞蛋殼膜中膠原蛋白平均提取率為0.91%。

雞蛋殼膜中膠原蛋白提取試驗的方差分析結果見表4，從方差分析表中可以看出，在酶解種類、pH值、酶用量、時間4個單因素中，酶用量和酶解時間為顯著因素，酶用量因素a＝0.1，時間因素a＝0.25，而酶種類以及pH值不為顯著性因素，從經濟節約以及簡便的角度考慮，選擇木瓜蛋白酶pH5、酶用量6%、反應時間5h為最優的膠原蛋白提取試驗工藝參數。

表4 正交試驗設計方差分析表Table 4 Analysis of variance for extraction rate of collagen with various hydrolysis conditions

3 結 論

通過L9(34)正交試驗得出從雞蛋殼膜中提取膠原蛋白的最佳工藝參數為選擇木瓜蛋白酶在pH5、酶用量6%，反應時間5h，在此條件下雞蛋殼膜中膠原蛋白的提取率達到0.91%。解決了廢棄雞蛋殼膜的環境污染問題，而且為膠原蛋白生產工業提供較大的實際利用價值，對蛋殼資源的綜合利用具有一定的指導意義。蛋殼膜膠原蛋白的提取是對蛋殼膜潛在價值的挖掘，使蛋殼膜成為提取膠原蛋白安全可靠的來源。

[1] 馬美湖. 禽蛋制品生產技術[M]. 北京: 中國輕工業出版社, 2003: 207-238.

[2] 汪之和, 施文正, 張麗華. 雞蛋殼制備檸檬酸-蘋果酸鈣的研究[J].食品研究與開發, 2003, 22(2): 115-117.

[3] 趙頌寧, 王麗艷, 羅姍姍, 等. 響應面法優化微波制備檸檬酸-蘋果酸復合鈣的工藝研究[J]. 食品工業科技, 2010(7): 249-255.

[4] 羅姍姍, 王麗艷, 趙頌寧, 等. 超聲波法制備蛋殼檸檬酸-蘋果酸復合鈣的優化研究[J]. 現代農業科技, 2010(5): 324-325.

[5] 王淑珍, 蕭煒, 陳亮. 蛋殼膜美容保健奶研制及其營養分析[J]. 食品工業, 2004(6): 41-42.

[6] KIYOSHI M, HIROSHI M. Poultry eggshell strengthening composition:US , 6660294[P]. 1999-04-02.

[7] 周艷華, 馬美湖, 蔡朝霞. 蛋殼膜中角蛋白與膠原蛋白的提取分離技術及功能多肽的研究[J]. 中國家禽, 2008, 30(15): 34-37.

[8] 焦道龍, 陸劍鋒, 張偉偉, 等. 水產動物膠原蛋白的研究現狀及發展趨勢[J]. 食品科學, 2009, 30(17): 334-338.

[9] 張根生, 范愛月, 韓冰, 等. 響應曲面法優化堿性蛋白酶提取林蛙殘體膠原蛋白[J]. 食品科學, 2011, 32(2): 93-97.

[10] LI H, LIU B L, GAO L Z, et all. Studies on bullfrog skin collagen[J].Food Chemistry, 2004, 84(1): 65-69.

[11] ZHAO Yuhong, 等. 蛋殼膜中提取出的膠原蛋白的表征[J]. 陳瓔潔,譯. 明膠科學與技術, 2009, 2(3): 132-135.

[12] LONG F D, ADAMS R G, DEVORE D P. Preparation of hyaluronic acid from eggshell membrane. US, 080388[P]. 2004-09-23.

[13] 趙玉紅, 高天. 鹿骨膠原蛋白特性的研究[J]. 食品科學, 2008, 29(7):43-46.

[14] 段宙位, 申鉉日, 陳秀明, 等. 羅非魚尾膠原蛋白的提取與鑒定[J].食品科學, 2012, 33(6): 59-64.

[15] 湯俊, 魏東芝, 張國鈞, 等. 膠原蛋白的高效制備及與明膠的鑒別[J].食品科學, 2010, 31(7): 54-60.

[16] 鐘朝輝, 李春美, 梁晉鄂, 等. 魚鱗膠原蛋白提取工藝的優化[J]. 食品科學, 2006, 27(7): 162-165.

[17] 劉靜波, 趙頌寧, 林松毅, 等. 酶解法提取黑木耳中膠原蛋白的工藝優化[J]. 農業工程學報, 2012, 28(13): 282-286.

[18] MIZUTA S, TANAKA T, YOKOYAMA Y, et al. Hot-water solubility of mantle collagens in several cephalopod molluscs[J]. Food Science and Technology, 2009, 75(8): 1337-1338.

[19] ISO 3496. Meat and meat products- determination of hydroxyproline content[S]. 1994.

[20] 沈同, 王鏡巖, 趙邦悌, 等. 生物化學: 上冊[M]. 2版. 北京: 高等教育出版社, 1980: 154-160.

Enzymatic Extraction of Collagen from Egg Shell Membrane

REN Meng，GONG Xin-tong，ZHAO Song-ning，ZHANG Yuan-yuan，SUN Yan-bo，YIN Jian-wei，LIU Jing-bo*
(Laboratory of Nutrition and Functional Food, College of Quartermaster Technology, Jilin University, Changchun 130062, China)

In order to establish an enzymatic method for collagen extraction from egg shell membrane, the influence of enzyme type, pH, enzyme dose, material-to-water ratio and extraction time on extraction efficiency was investigated and these extraction parameters were optimized one-factor-at-a-time experiments combined with an L9(34) orthogonal array design. The optimal extraction condition was hydrolysis for 5 h with 6% papain at normal temperature and a material-to-water ratio of 1:100 (g/mL),resulting in an extraction rate of 0.91%. As a result, an efficient extraction method was obtained. Collagen extraction from egg shell membrane by this method not only avoids environmental pollution caused by abandoned egg shell membrane, but also has great practical value in the collagen production industry.

egg shell membrane；collagen；enzymolysis；extraction

TS253.9

A

1002-6630(2012)16-0096-04

2011-08-18

吉林大學本科生創新計劃項目

任萌(1991—)，女，本科生，研究方向為營養與功能食品。E-mail：happy13347008277@sina.com

*通信作者：劉靜波(1962—)，女，教授，博士，研究方向為營養與功能食品。E-mail：ljb168@sohu.com