竹葉黃酮在豆漿保鮮中的應用

魏鳳玉，方 菊，陳 瑋，楊艷明

(合肥工業大學化學工程學院，安徽 合肥 230009)

竹葉黃酮在豆漿保鮮中的應用

魏鳳玉，方 菊，陳 瑋，楊艷明

(合肥工業大學化學工程學院，安徽 合肥 230009)

采用平板計數法研究竹葉黃酮(BLF)對豆漿中細菌的抑制作用和保鮮效果。結果表明：4℃時添加0.01% BLF對豆漿的保鮮效果較好，而30℃時BLF的最佳用量為0.015%；感官評定結果顯示，添加0.01%～0.015%的BLF對豆漿的色澤和風味均無不良影響，且可使保質期延長6h；香蘭素與BLF對豆漿的保鮮效果具有一定協同作用，30℃時添加0.015% BLF與香蘭素質量比為4:1的復合保鮮劑，可使豆漿的保質期延長8h。

竹葉黃酮；豆漿；香蘭素；天然保鮮劑

豆制品富含蛋白質、鈣等無機鹽和各種維生素，營養豐富易消化，為中國人最喜愛的食品之一。目前常采用添加化學防腐劑苯甲酸、山梨酸等[1]對豆制品進行保鮮，但它們可能對產品的口感產生不良的影響，且化學添加劑可能會對人體產生一定的毒副作用。隨著人們對食品安全性的要求日趨增高，食品防腐劑的天然化、營養化己成為保鮮技術的發展趨勢。

竹葉黃酮具有抗自由基、抗氧化等生物活性作用[2-5]，并對常見食物腐敗菌-金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、黑曲霉、啤酒酵母和青霉菌有較好抑菌活性[6-7]，因此研究人員探索將其用于食品的防腐保鮮。樓鼎鼎等[8]探索了竹葉黃酮在中式香腸中的應用效果，發現添加0.01%～0.02%的竹葉黃酮能顯著增強產品抗氧化性能，且對中式香腸的色澤、風味和口感均無不良影響；Zhang Yu等[9]將竹葉提取物應用于薯片、炸薯條等膨化食品，研究表明當添加0.1%竹葉提取物時，可使食品中丙烯酰胺的含量降低74.1%，同時改善產品的抗氧化性能。竹葉黃酮具有良好的藥理活性、極低的毒副作用[10]和清新甜香的獨特風味，作為高效低毒、經濟實用的食品防腐劑具有廣闊的應用前景。本實驗將竹葉黃酮(bamboo leaves flavonoids，BLF)應用于豆漿中，結合低溫和常溫保存，考察其防腐抗菌效果；并將BLF與香蘭素復配，考察常溫下對豆漿保鮮效果的影響，為開發豆制品的天然防腐劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮毛竹葉采自安徽省六安市；蘆丁對照品(純度99.99%) 中國藥品生物制品檢定所；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂、黃豆 市售；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LRHS-150B恒溫培養箱 上海躍進醫療器械有限公司；SF-CJ-1凈化工作臺 上海三發科學儀器有限公司；LB-50L立式圓形壓力蒸汽滅菌鍋 華凌醫療設備制造有限公司；ACQUITY UPLC高效液相色譜儀 美國Waters公司；722P可見分光光度計 上海光譜儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 竹葉黃酮制備和分析方法

準確稱取洗凈、烘干、粉碎過20目篩的竹葉粉末3.0g，按固液比1:18(g/mL)加入60%乙醇溶液，在70℃熱回流提取3次，時間分別為2.5、1.5、1.0h，合并提取液。經絮凝除雜后過濾、濃縮除溶劑，用蒸餾水溶解。再將竹葉黃酮水溶液過AB-8大孔樹脂柱吸附，90%乙醇水溶液洗脫，洗脫液旋蒸回收溶劑，將濃縮液烘干，所得固態物質用于HPLC-MS分析，鑒定出BLF中含有4種黃酮物質，分別為葒草苷或異葒草苷、蘆丁、異鼠李素-3-O-β-D-蕓香糖苷和槲皮素-3-O-β-D-glu(1-2)-α-L-鼠李糖苷，總含量達78.21%。實驗以蘆丁為對照品，采用分光光度法[11]測定BLF中的黃酮含量。

1.3.2 BLF對豆漿保鮮的實驗

竹葉黃酮具有廣譜抗菌作用，對食源性菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、β-嗜堿芽孢桿菌等均有顯著的抑制作用[6-7]。根據文獻[12]報道的竹葉黃酮對大腸桿菌的最小質量分數及課題組前期的實驗結果，確定豆漿中BLF的質量分數(以蘆丁質量計，下同)為0.003%、0.01%、0.015%、0.02%。實驗將BLF以不同質量分數添加到新鮮豆漿中，密封后分別置于4℃和30℃保存，在不同時間內，采用GB 4789.2—2010《食品微生物學檢驗：菌落總數測定》中的平板計數法測定菌落數，以蒸餾水作對照。

1.3.3 BLF與香蘭素復配對豆漿保鮮實驗

香蘭素(vnillin)在食品上除具有增香和定香作用外，還具有殺菌抑菌作用[13]，是一種有應用潛力的抗微生物劑，目前已應用于牛奶[14]、豆腐[15]和鮮切水果[16]等的保鮮。但vnillin的添加量不易控制，稍過量將對產品風味產生較大的影響。已有研究表明，vnillin與醛、酮和酚等物質在抗菌防腐方面有協同增效作用[17]。由于人工合成vnillin成本較低，若將其與BLF復配，可實現保鮮劑的高效、價廉、天然無毒。本實驗將B LF和vnillin以質量比為1:4、2:3、3:2、4:1進行復配，控制豆漿中復配物的質量分數為0.015%，考察30℃時復配物對豆漿保鮮效果的影響。

1.3.4 評價指標

感官評價：根據豆漿在放置期間色澤、氣味和組織狀態3方面的變化，制定評分標準，見表1。試驗參加人員10人，均為在校師生。實驗考察BLF及其與vnillin復配物對豆漿不同時間感官的影響，4℃實驗組(EP)添加0.01% BLF，30℃實驗組1(EP1)添加0.015%BLF，實驗組2(EP2)添加0.015% BLF和vanillin復配物(質量比4:1)，空白組(CK)以純豆漿作為對比。

表1 豆漿感官評定標準Table 1 Scoring criteria for sensory evaluation of soybean milk

2 結果與分析

2.1 BLF對抑菌率的影響

表2 BLF 質量分數對抑菌率的影響Table 2 Effect of BLF concentration on antibacterial efficacy%

由表2可知，30℃時BLF對豆漿的抑菌效果明顯好于4℃，這可能是由于低溫下菌的生長速度較慢，BLF對其抑制作用相對較小；常溫30℃時食源性菌生長較為活躍，使BLF抑菌效果得到了表現，從而具有相對較高的抑菌率。比較不同質量分數BLF對豆漿的保鮮效果可看出，BLF質量分數越高，其抑菌效果越好，但加入0.02% BLF后豆漿的色澤較深，呈灰黃色，與純豆漿的色澤有較大的差別。實驗還發現，添加BLF后豆漿的pH值幾乎不變，綜合考慮，確定4℃和30℃時BLF的添加量分別為0.01%、0.015%。

2.2 BLF與香蘭素復配對抑菌率的影響

從圖1可看出，純vnillin在豆漿中的抑菌作用明顯低于純BLF，且vnillin的抑菌率隨時間變化不明顯，而BLF的抑菌率則隨著時間的延長而提高，這說明BLF的抑菌作用具有較好的持久穩定性，對于食品的長時間保鮮有一定的應用價值。在vnillin中添加BLF后，其抑菌效果增加，且復配液中BLF濃度越高，其抑菌效果越好，但當復配液中BLF含量低于80%時，其抑菌效果雖然好于純vnillin但比純BLF還低；只有當復配液中BLF含量為80%時，抑菌效果最好。表明BLF和vnillin對豆漿的保鮮有一定的協同增效作用，可能是由于BLF和vnillin對菌的抑制作用和機理不同，vnillin對豆漿前期生長出的菌有較強的抑制性，而BLF的抑菌效果則表現為中后期。綜合對比，選取BLF和vnillin的最佳復配比為4:1。

圖1 BLF與Vnillin的復配比對抑菌率的影響Fig.1 Effect of BLF-to-vanillin ratio on antibacterial efficacy

2.3 豆漿的感官評價

根據表1感官評定標準，6～9分時，豆漿呈均勻的淡黃色且有豆香味，可供食用，在保質期內。據此，從表3可知，4℃時純豆漿的保質時間約為14h，而加入BLF后，豆漿在20h時仍具有豆香味、未出現分層現象，在20～24h期間開始出現腐敗現象，顏色變深、有異味產生，40h時豆漿已變成灰黃色、有強烈的氨味、出水分層嚴重，完全腐敗，即添加0.01% BLF的豆漿保質時間達20h，比純豆漿延長了6h。溫度升高，豆漿腐敗的速率加快，保鮮時間縮短。30℃時純豆漿的保質時間約為8h，而加入BLF后，豆漿在14h時仍具有豆香味，未出現分層現象，在14～22h期間開始出現腐敗現象(圖2)，即添加0.015%的BLF的豆漿保質時間約為14h左右，延長了6h；添加0.015% BLF和Vanillin復配液后，豆漿的保質時間約為16h左右，延長了8h。

圖2 30℃時豆漿中加入BLF與vanillin復配物20h后的照片Fig.2 Photos of soybean milk stored at 30℃ for 20 h after addition of BLF-vanillin mixture

2.4 竹葉黃酮抑菌機理的探討

因豆漿在存放過程中產生的菌落數較多，因此總菌落數取以10為底的對數作為縱坐標，以培養時間為橫坐標，繪制豆漿中菌的生長曲線。從圖3a可知，4℃時細菌的生長曲線呈現雙增長峰，BLF對豆漿中菌落的生長規律沒有改變。菌落在0～14h處于對數生長期，14～20h處于穩定期，20～24h處于衰亡期，而24～40h期間豆漿菌落數突增，再次出現生長高峰。此規律與瓶裝飲用純凈水中細菌數量變化的研究結果極其相似[18]。這可能是豆漿中兩種不同類型腐敗菌生長結果的累加。李博等[19]研究表明，豆制品在放置的不同時期，其內部的主要微生物不同。新鮮豆漿中主要以芽孢桿菌為主，放置24h后以屎腸球菌為主；新鮮豆漿中含有大量的蛋白質，芽孢桿菌分解蛋白質的能力較強，因而能利用蛋白質生長，形成第1個生長高峰，隨著蛋白質被逐漸分解，芽孢桿菌的營養物質減少，其生長進入衰亡期。而屎腸球菌則利用芽孢桿菌分解蛋白質的產物(如氨基酸等)作為營養物質，形成第2個生長高峰。由圖3b可看出，30℃時添加0.01%BLF后豆漿中菌落的生長規律同豆漿原液相近，菌落在0～16h處于對數生長期，16～18h處于穩定期，18～22h處于衰退期；而添加0.015%和0.02% BLF后豆漿中菌落的生長受到了明顯抑制，對數生長期縮短，14h即到達穩定期，16～22h處于衰退期。此時，菌落的生長曲線僅出現一個高峰，符合菌落的一般生長周期[20]，若持續考察22h后豆漿中菌的生長情況，可能也會出現與4℃時相同的現象，形成第2個生長高峰。

表3 豆漿的感官評價結果(n=10)Table 3 Sensory evaluation results for soybean milk (n=10)

抗微生物物質的作用方式主要有以下幾種：損傷細胞壁；改變細胞的通透性；改變蛋白質和核酸分子，抑制酶的作用；作為抗代謝物，抑制核酸的合成等[21]。從圖3還可知，添加一定量的BLF后豆漿中的菌落數降低，表明BLF對菌的生長繁殖和代謝可能均產生了一定的影響，抑制作用發生在指數生長期。結合竹葉黃酮的結構和抗微生物的作用機制，推測BLF的抑菌機理主要有兩種可能：1)BLF為黃酮類物質，易與糖類結合生成黃酮苷，從而能夠水解細菌細胞壁中的糖苷鍵，破壞細胞壁結構，使其失去對細胞的保護作用，造成菌體死亡[22]；2)BLF分子中既有親水性基團羥基和疏水基團，親水性基團可以與細菌細胞膜磷脂上的磷酸基形成復合物，而疏水基團可以插入膜的脂肪酸鏈之間，解聚細胞膜的結構，使細胞膜的通透性增加，細胞破裂死亡[20]。有關BLF的詳細抑菌機理，有待進一步探索研究。

圖3 BLF對豆漿中菌落生長曲線的影響Fig.3 Effect of BLF on growth curve of bacteria in soybean milk

3 結 論

竹葉黃酮對豆漿中的微生物有較好的抑制作用，同時對產品的色澤、質地及其他感官品質無不良影響。當BLF在豆漿中的添加量為0.01%～0.015%時，可使豆漿的保質期延長6 h；香蘭素在豆漿中的抑菌作用弱于BLF，但將兩者復配對豆漿的保鮮效果具有一定的協同作用。30℃時添加0.015%的BLF與香蘭素質量比為4:1的復合保鮮劑，可使豆漿的保質期從8h延長至16h，增加了8h。竹葉黃酮以其良好的抑菌性、安全無毒和獨特清香，將在豆制品和其他食品的防腐保鮮上具有良好地應用前景。

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Application of Bamboo Leaf Flavonoids for Preservation of Soybean Milk

WEI Feng-yu，FANG Ju，CHEN Wei，YANG Yan-ming
(School of Chemical Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The effect of bamboo leaf flavonoids (BLF) on bacterial inhibition and quality preservation of soybean milk was investigated by plate culture count in the present study. The addition of 0.01% (wt %) BLF has an obvious fresh-keeping effect on soybean milk during storage at 4 ℃, and the optimal BLF dose for preserving soybean milk at 30 ℃ was 0.015% (wt %). Sensory evaluation displayed that 0.01%－0.015% (wt %) of BLF had no impact on the color and flavor of soybean milk, and BLF could prolong its preservation time from 8 h to 14 h. A synergistic effect of vanillin and BLF against spoilage microorganisms in soybean milk was also achieved. The shelf life of soybean milk stored at 30 ℃ could be prolonged from 8 h to 16 h when 0.015%(wt %) of BLF and vanillin mixture (at a mass ratio of 4:1) was applied.

bamboo leaf flavonoids；soybean milk；vanillin；natural preservative

Q946.841

B

1002-6630(2012)18-0312-04

2011-09-02

國家大學生創新性實驗計劃項目(091035947)

魏鳳玉(1963—)，女，教授，博士，研究方向為化工傳質與分離。E-mail：weifyliuj@yahoo.com.cn