綠色木霉菌發酵液對芒果采后病害及品質的影響

葉偉娟，馮衛華，于 新,*，吳少輝，蔣 雨

(1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.四川農業大學食品學院，四川 成都 611130)

綠色木霉菌發酵液對芒果采后病害及品質的影響

葉偉娟1，馮衛華1，于 新1,*，吳少輝1，蔣 雨2

(1.仲愷農業工程學院輕工食品學院，廣東 廣州 510225；2.四川農業大學食品學院，四川 成都 611130)

研究木霉菌發酵液對控制芒果采后病害及腐爛的作用。以紫花芒果果實為材料，使用綠色木霉菌(Trichoderma viridePers.ex Fr.)發酵液涂抹果實，于(30±5)℃、相對濕度90%～95%貯藏，測定果實病斑數及面積、硬度和色澤指數。結果表明：紫花芒果貯藏至第9天，T. viride發酵液處理組腐爛指數僅為31.1%，對照組腐爛指數則達51.9%；損傷接種至7d時，T. viride發酵液處理組的病斑面積比對照組的小69.7%；貯藏至30d，T. viride發酵液處理的芒果自然發病率較清水處理組的低36.7%。T. viride發酵液處理組的芒果在貯藏6d后變軟，比對照組延緩了3d。T. viride發酵液混合CMC處理的果實轉黃速度較對照組延緩了3d。T. viride發酵液可顯著減低損傷接種芒果的腐爛指數、病斑面積和接種發病率。

綠色木霉菌；發酵液；芒果炭疽菌；病害；品質

芒果(Mangifera indicaLinn)屬漆樹科植物，為熱帶地區廣為種植的一種呼吸躍變型水果。我國盛產芒果的地區主要有海南、廣東、廣西、云南、四川等地。炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioidesP. Henn)是芒果采后貯藏過程中影響最大的病原菌之一[1]，具有潛伏侵染特性[2-3]， 貯運期間引起的芒果發病率可達30%～50%，造成巨大的經濟損失。目前，多采用農藥、殺菌劑、防腐劑等化學方法進行芒果采后病害防治，但都存在一定食品隱患。因此，無毒、無污染、高效的天然果蔬保鮮劑的研究與開發越來越受到研究人員重視。

綠色木霉菌(Trichoderma viridePers.ex Fr.)能夠代謝產生多種具有抗生活性的物質[4-6]，如水解酶類、多肽類、萜類、抗生類物質等，在植物病害生防中起重要的作用[7-8]，但未見其發酵液用于防治果蔬采后病害。在前期體外研究T.viride發酵液對芒果炭疽菌抑制作用的基礎上[9]，本實驗將T.viride發酵液應用于芒果采后處理，研究其采后病害的防治效果及其對芒果貯藏品質的影響，為探討以T.viride發酵液替代化學殺菌劑防治芒果采后病害提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花芒(Mangifera indicaL. cv. Zihua)，2010年6月采于廣州市番禺區仲愷農業工程學院農場，選擇果實硬度均值大于15kg/cm2，果面為綠色，大小、成熟度一致的芒果進行試驗；T. viride廣東省微生物菌種保藏中心；C. gloeosporioides仲愷農業工程學院微生物實驗室。

馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養基：液體培養基優化配方為質量分數77%水、20%土豆、2%葡萄糖、1%玉米粉、1‰聚山梨酯，pH9，培養基經121℃滅菌30min，備用。

1.2 儀器與設備

FA1004電子天平 德國Sartorial公司；PHS-25型酸度計 上海偉業儀器廠；DHZ-DA搖床 太倉市實驗設備廠；SYQ-DSX-280B滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SW-CJ-IF型無菌超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；LRH-250A 型生化培養箱 廣東省醫療器械廠；R201D-II型旋轉蒸發儀 無錫星海王生化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1T. viride發酵液制備

T. viride活化培養72h，加無菌水制成108CFU/mL菌懸液，備用。于250mL錐形瓶分別裝入50mL液體培養基、150μLT. viride菌懸液，置32.5℃、120r/min恒溫搖床發酵7d。發酵完成后，過濾除去菌絲，轉入無菌離心管中4℃、6000r/min離心15min，取上清液，用0.22μm濾膜過濾。分別旋轉蒸發濃縮至原體積的1/2、1/4、1/8，置于4℃冷藏備用。

1.3.2 芒果接種發病率測定

將28℃培養10d的C. gloeosporioides用無菌水配制成孢子懸浮液。用血球計數板，將孢子濃度調至1× 106個孢子/mL，備用。芒果采收后，剔除病、傷果。選擇果實硬度均值大于15kg/cm2，果面為綠色、大小、成熟度一致的芒果。分別用70%酒精和無菌水擦拭果實表面進行清潔，然后用注射器注射芒果炭疽菌孢子懸浮液，每果接種5個[10]。

用無菌棉蘸T. viride發酵液覆蓋接種點1min，共3次，然后自然晾干。以無菌水處理的芒果為對照。每組處理50個芒果，重復3次，室溫(30±5)℃、90%～95%相對濕度(relative humidity，RH)條件貯藏。每天觀察芒果發病率，利用十字交叉法測量病斑直徑(d)。分別取芒果病斑外2cm周圍的果肉和遠離病斑的健康組織果肉待測各指標。

1.3.3 芒果自然發病率測定

CMC黏度高、延展性強，有利于T. viride濃縮發酵液均勻地粘附在芒果表面，本實驗添加CMC作為成膜劑。用清水清洗芒果，晾干分為3組，每組50只。采用浸涂法處理，分別用 0.05g/mL CMC溶液、含10% (V/V)T. viride濃縮發酵液的羧甲基纖維素(CMC)溶液(質量濃度0.05g/mL)進行浸涂處理，另一組不處理為對照組。貯藏過程中記錄發病及病斑情況，自然發病率計算公式如下[12]：

結合本實驗芒果大小及接種的點數等因素綜合進行分級[13]：0級：未發??；1級：病斑面積＜2cm2；2級：病斑面積＜8cm2；3級：病斑面積＜14cm2；4級：病斑面積＞14cm2。

1.3.4T. viride發酵液濃度對芒果果實腐爛面積的影響

80只芒果清洗后分4組進行損傷接種，分別用濃縮倍數為2、4、8倍的T. viride發酵液處理，以無菌水處理為對照組，每天觀察病斑大小。

1.3.5 芒果果實硬度測定

圍繞果實腰部，各取4個點，削去果皮，用GY-1型硬度計測定果實硬度[14]。每個處理每次測定3個果實，重復3次。

1.3.6 芒果色澤指數測定

觀察每個處理的芒果果實果皮色澤變化。果皮顏色評價的色澤分為：0級：全綠；1級：果蒂轉黃；2級：果面＜25%轉黃；3級：果面25%～50%轉黃；4級：果面50%～75%轉黃；5級：全部轉黃[15-16]。色澤指數計算公式如下：

1.3.7 數據統計與分析

Excel 2003統計分析數據，每項個測定均重復3次，結果表示為平均值±標準差。應用SPSS 10.0軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)對數據進行方差分析，并利用鄧肯氏(Duncan)多重比較進行差異顯著性分析。P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1T. viride發酵液對芒果果實腐爛及病斑面積的影響

接種芒果炭疽菌后，隨著貯藏時間的延長，芒果果實開始發病，并且病斑面積不斷擴大，如圖1A所示。與對照相比，用T.viride發酵液處理的芒果感染C.gloeosporioides的腐爛指數(圖1B)和病斑面積同期較小。在前6d，腐爛情況都較輕，腐爛指數均小于10%。到第7天，對照組腐爛指數陡然增加，至26.1%，處理組僅為10.3%。第9天，對照組腐爛指數達51.9%，處理組腐爛指數僅為31.1%。

圖1 不同處理的芒果在貯藏過程中的病斑發展(A)和腐爛(B)情況Fig.1 Disease spot and decay status of mango fruits with different treatments during storage

2.2T. viride發酵液對接種發病率和自然發病率的影響

圖2 T.viride發酵液和CMC處理對芒果采后發病率的影響Fig.2 Effect of individual and combined fermentation broth and CMC on the incidence rate of diseases in post-harvest mango fruits

在實驗條件下，清水和CMC處理組芒果的發病率無明顯差異。說明CMC對C. gloeosporioides不具有抑制作用。3個處理組的芒果自然發病率均隨貯藏時間延長而增加，T. viride發酵液處理組的芒果自然發病率均低于其他處理組同期的發病率(圖2)。貯藏至30d，T. viride發酵液處理組芒果發病率較清水處理組低36.7%。

接種處理后6d內，T. viride發酵液處理組接種發病率都維持在較低水平，對照組在第6天已出現發病高峰，說明T.viride發酵液有效延遲了芒果果實接種發病高峰。芒果果實接種處理至6d，T.viride發酵液處理顯著降低了芒果果實接種發病率，僅為26.2%，對照組接種發病率已達76.4%。7d后，T.viride發酵液處理組與對照組間的差異逐漸縮?。坏?天，兩組芒果果實的接種發病率均超過98%(圖3)。

圖3 接種炭疽菌芒果的貯藏發病情況Fig.3 Effect of fermentation broth of Trichoderma viride on the disease incidence rate of mango fruits inoculated with Colletotrichum gloeosporioides during storage

2.3T.viride發酵液濃度對芒果果實發病情況的影響

圖4 不同濃度T.viride發酵液處理芒果在貯藏期間的腐爛情況Fig.4 Effect of concentrated fermentation broth of Trichoderma viride on the decay index of mango fruits during storage

在相同貯藏時間內，隨著T.viride發酵液濃度增加，芒果腐爛面積越小，且T. viride發酵液處理組芒果腐爛面積始終小于對照組(圖4)。貯藏至6d，濃縮8、4、2倍的T. viride發酵液處理組芒果病斑面積分別為4.4、9.8、14.5cm2，均小于對照組(19.9cm2)。濃縮2、4、8倍的T. viride發酵液處理的芒果分別推遲1、2、2.5d，才達到對照組同等腐爛面積。

2.4T. viride發酵液對芒果果實硬度的影響

芒果采后隨著貯藏期的延長，果實硬度減小。T.viride發酵液處理組和對照組的變化趨勢相同，但硬度下降幅度不同(表1)。貯藏至第3天，對照組果實硬度急劇下降，由(10.76±0.45)kg/cm2驟降至(2.98± 0.31)kg/cm2(5d)；第6天，T.viride發酵液處理組的芒果硬度才出現急劇下降。第6天后，兩處理組的果實均后熟軟化，硬度差異不顯著，維持在2.86～2.65kg/cm2范圍內。

2.5T. viride發酵液對芒果色澤轉化情況的影響

在貯藏過程中，T. viride發酵液混合CMC處理的芒果果實轉黃較遲。貯藏至6d，該組果實的轉黃率才有明顯提高，達60.3%，其他兩組的轉黃率在第3天已達60%。僅用CMC處理的芒果果實速度較快，轉黃率高于對照組果實，第9天時，色澤指數達85.2%，對照組僅為69.3%。貯藏至第9天，T. viride發酵液混合CMC處理組的色澤指數超過了對照組(圖5)。

表1 貯藏過程中芒果硬度變化Table 1 Hardness change of mango fruits receiving and not receiving treatment with fermentation broth of Trichoderma viride during storage kg/cm2

圖5 貯藏期間不同處理的芒果色澤變化Fig.5 Color change of mango fruits receiving and not receiving treatment with fermentation broth of Trichoderma viride during storage

3 討論與結論

T.viride發酵液可顯著減低損傷接種芒果的腐爛指數、病斑面積和接種發病率。貯藏至第9天，對照組的腐爛指數達51.9%，T.viride發酵液處理組腐爛指數為31.1%；損傷接種至7d時，T.viride發酵液處理組的病斑面積比對照組小69.7%；貯藏至30d，T.viride發酵液處理組自然發病率較對照組低36.7%。損傷接種7d后，T.viride發酵液處理組與對照組間的接種發病率差異逐漸縮小，第9天，兩組芒果果實的接種發病率均超過98%，這是果實后熟及衰老的結果。結合前期的體外抑菌實驗結果，這可能是T.viride發酵液中抗生物質對C.gloeosporioides的抑制作用，從而延緩了芒果的腐爛。關于T.viride發酵液中抗生物質組成，尚在進一步研究之中。

芒果是典型的呼吸躍變型果實，不耐貯藏。芒果采后隨著貯藏期的延長，果實轉黃，硬度下降。在室溫(30±5)℃貯藏期間，T.viride發酵液處理組和對照組的硬度均不斷下降，但T.viride發酵液處理組的芒果在貯藏5d后變軟，比對照組推遲了2d。兩處理組的芒果成熟軟化后的硬度差異不顯著，均維持在2.86～2.65kg/cm2范圍內。果實后熟期間葉綠素降解，同時胡蘿卜素等色素積累，果實由綠轉黃。在貯藏過程中，3組芒果的顏色均逐漸由綠色轉為黃色，色澤指數不斷升高。不同處理組的轉黃速度不同，T.viride發酵液混合CMC組＜對照組＜CMC組。

總而言之，T.viride發酵液處理能顯著抑制芒果炭疽病的發生，減輕芒果采后病害，并延緩芒果的后熟生理作用，有利于芒果的貯藏、運輸。這可能是因為T.viride發酵液處理后，抑制了芒果的呼吸作用，延遲了呼吸高峰的到來。黃雪蓮[17]采用氣相色譜-質譜聯用儀對T.viride發酵液的化學成分進行定性分析，主要是(E,E)-2,4-己二烯醛、3-吡啶酚、甲基-(5-羥基-1H-2-苯并咪唑)氨基甲酸酯、柏木醇、δ-芹子烯、間氟芐胺、2,3-二氫-4H-1-苯并噻喃-4-酮、9-芴酮等。其抗生物質的抑制機理可能有兩方面：1)抗生物質能夠通過病原真菌的細胞膜，并改變真菌細胞的超微結構，破壞其細胞壁、細胞膜的結構與功能，引起細胞內容物流出導致真菌死亡；2)抗生物質通過抑制真菌的DNA、蛋白質的合成或RNA的轉錄而表現抑菌效應。關于T.viride發酵液誘導芒果采后抗病性的機制，還有待下一步研究，以期對T.viride發酵液處理對芒果采后病害的防治機理更深入了解。

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Effect of Fermentation Broth ofTrichoderma virideon Postharvest Diseases and Quality of Mango Fruits

YE Wei-juan1，FENG Wei-hua1，YU Xin1,*，WU Shao-hui1，JIANG Yu2
(1. College of Light Industry and Food Science, Zhongkai University of Agriculture and Engineering, Guangzhou 510225, China；2. College of Food Science, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China)

In order to control post-harvest diseases of mango, mango fruits (Mangifera indicaL. var Zihua) were coated with fermentation broth ofTrichoderma virideand stored under the conditions of 90%－95% humidity and (30 ± 5) ℃. Disease spot number, hardness and color index were determined during the storage of mango fruits. On the 9th day, the decay index of mango fruits from the control group was as high as 51.9%, while that of mango fruits coated with fermentation broth ofT. viridewas only 31.1%. On the 7th day after inoculation ofColletotrichum gloeosporioidesP. Henn, disease spot area in the coating group was 69.7%, which was much lower than that in the control group. On the 30th day during the storage, natural incidence rate of diseases in mango fruits coated with fermentation broth ofT. viridewas 36.7%, which was also lower than that in the blank control. The mango fruits treated with fermentation broth ofT. viridewere soften after 6-day storage and revealed an extension of shelflife by 3 days when compared with the control. Combined treatment with fermentation broth ofT. virideand CMC could result in a delay for turning yellow of mango fruits by 3 days. Therefore, fermentation broth ofT. viridecoating can significantly decrease decay index, disease spot area and the incidence rate of diseases in mango fruits.

Trichoderma viride；fermentation broth；Colletotrichum gloeosporioidesP. Henn；disease；quality

S667.7

A

1002-6630(2012)18-0265-05

2011-08-05

國家自然科學基金項目(30871765)

葉偉娟(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為農產品加工與貯藏工程。E-mail：yeweijuan0301@126.com

*通信作者：于新(1959—)，男，教授，博士，研究方向為農產品加工與貯藏。E-mail：yuxin1959@yahoo.com.cn