液相色譜法與氨基酸分析法測定食品中甘氨酸的比較研究

劉小力

(國家食品質量安全監督檢驗中心，北京 100094)

液相色譜法與氨基酸分析法測定食品中甘氨酸的比較研究

劉小力

(國家食品質量安全監督檢驗中心，北京 100094)

建立對食品中游離甘氨酸經提取、凈化等處理后，鄰苯二甲醛衍生，經高效液相色譜測定分析，并將該方法與氨基酸分析儀測定甘氨酸的方法進行比較研究。通過對市售的液體乳、含乳飲料(品)類和植物蛋白飲料(品)類中游離甘氨酸分別應用兩種方法進行測定，結果表明，氨基酸分析儀法測定甘氨酸具有測定結果穩定準確、檢出限低和操作簡單的特點，而液相色譜法(熒光檢測器)測定甘氨酸檢測時間快，檢出限也能滿足常規檢測的需要，因此，在實際應用中，兩種方法均可采用，可作為互相驗證的方法。

甘氨酸；液相色譜；氨基酸分析

近年來，我國相繼出現了奶粉中添加乳清粉、添加動物水解蛋白、三聚氰胺的惡性食品安全事件。甘氨酸是氨基酸系列中結構最為簡單，人體非必需的一種氨基酸，在國內外應用廣泛[1]。在我國的GB 2760—2011《食品添加劑使用衛生標準》中，甘氨酸被列為合成香料的一種，標準中規定其使用范圍為調味料及豆奶，最大使用限量為1.0g/kg[2]。近年來，我國出現一些不法企業為了提高蛋白質含量，用成本較低的甘氨酸來代替乳粉，甚至在生產過程中違規使用或摻雜工業級甘氨酸，制造劣質或完全不含有乳成分的假“乳飲料”，其添加量甚至遠遠超出GB 2760—2011中規定的1.0g/kg，給消費者帶來潛在的安全隱患。在我國，根據GB 2760—2011規定，含乳飲料中未將甘氨酸作為可以使用的食品添加劑[2]。在美國，根據食品藥品管理局(Food and Drug Administration，FDA)關于食品添加劑使用范圍及限量的有關規定[3]，甘氨酸作為特殊膳食和營養添加劑可在所有食品中添加，但添加后食品中最終的甘氨酸總量(以游離氨基酸計)小于等于總蛋白質質量的3.5%[4]。在我國，由于產品標準有關于蛋白質含量的要求，一些不法企業為了使產品的蛋白質達標，早期的辦法是提高產品中牛奶(或奶粉)的含量，但這樣產品的成本也就會隨之增高。而使用甘氨酸正好達到降低成本又使蛋白質含量達標這一目的，奶粉的蛋白質含量一般為25%，但甘氨酸的蛋白質含量為100%，也就是說，在產品中僅添加1份甘氨酸，便可達到使用4份奶粉的效果[5]。這些不法企業，為牟取暴利，鉆標準不完善的空子，不顧消費者的健康和利益，在生產過程中大量使用或摻雜工業級甘氨酸，制造劣質或不含乳成分的“乳飲料”，這樣的“乳飲料”由于使用工業級的甘氨酸重金屬溶劑殘留等有害物質，危害人體健康。

因此，建立快速、易于推廣的甘氨酸檢測方法，將為政府監管提供有力的技術支撐。根據現有的研究基礎，甘氨酸測定方法有紙色譜法、離子交換色譜法、反相高效液相色譜法、毛細管電泳法、薄層色譜法、氣相色譜法等[6]。本實驗選擇鄰苯二甲醛(OPA)柱前衍生-液相色譜和氨基酸分析儀建立甘氨酸的定性、定量測定方法，并將兩種快速測定方法進行比較分析，為避免違法濫用甘氨酸情況的出現提供技術上的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

液體乳、含乳飲料(品)類和植物蛋白飲料(品)類市購。

甘氨酸標準品(純度＞99%)、鄰苯二甲醛(OPA)、巰基乙醇、乙腈、乙酸銨；氨基酸分析用試劑(檸檬酸三鈉、氫氧化鈉、氯化鈉、鹽酸、檸檬酸、乙酸鈉、冰醋酸、無水乙醇、乙二醇甲醚、茚三酮)均為優級純；0.4mol/L硼酸鈉緩沖液；衍生試劑的配制：稱取0.1g OPA用10mL甲醇溶解，加0.1mL乙硫醇，用0.4mol/L硼酸鈉緩沖液定容至100mL。

1.2 儀器與設備

1100高效液相色譜儀(帶熒光檢測器) 美國安捷倫公司；L-8800氨基酸分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 提取和凈化

準確量取液體乳、含乳飲料或植物蛋白飲料5.0mL于燒杯中，液體乳和乳飲料(品)類樣品中加1倍乙腈振搖，植物蛋白飲料樣品加2.5倍乙腈振搖，濾紙過濾(待樣品出現絮狀沉淀后過濾)，濾液經0.45μm微孔濾膜過濾后上機測定。

如樣品中游離甘氨酸的含量較高時，可將濾液用水適當稀釋，使樣液的最終質量濃度在標準曲線的范圍之內。

1.3.2 液相色譜測定

1.3.2.1 測定方法

樣品中游離甘氨酸經提取、凈化等處理后，用鄰苯二甲醛衍生，其衍生物經高效液相色譜分離，于熒光檢測器檢測。

1.3.2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent EclipseXDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動相：A為0.02mol/L乙酸銨溶液65%，B為25%乙腈，C為10%甲醇；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10μL；熒光檢測器：Ex＝330nm，Em＝460nm。

1.3.2.3 定性、定量方法

采用標準物質的保留時間對樣品峰進行準確定性，采用外標法以峰面積計算定量，依次配制不同質量濃度的甘氨酸標準溶液進樣分析，以質量濃度/(μg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.3 氨基酸分析儀測定

食品中游離氨基酸，經氨基酸分析儀的離子交換柱分離后，按照氨基酸分析儀設定的洗脫程序，用不同離子強度、pH值的緩沖液依次將氨基酸按吸附力的不同洗脫下來(先酸性氨基酸再中性氨基酸最后堿性氨基酸)，被洗脫下來的氨基酸與茚三酮反應液在加熱的條件下反應(135℃)，生成可在分光光度計中570nm和440nm檢測到的藍紫色物質(仲氨生成淺黃色物質440nm檢測)外標法定量[7]。甘氨酸為中性氨基酸，在10min左右出峰。

2 結果與分析

2.1 前處理方法的設定

比較采用1)透析袋去除大分子蛋白質[8]；2)采用95%乙醇除蛋白的方法[9]；3)采用蛋白沉降劑20%醋酸鋅和15%亞鐵氰化鉀沉降蛋白[10]；4)乙腈除蛋白方法。實驗結果表明，乙腈除蛋白效果較好，方法簡單且回收率較高，對甘氨酸測定無干擾。因此，針對液體乳、乳飲料、植物蛋白飲料等食品，本實驗采用乙腈除蛋白的凈化方法。

2.2 OPA柱前衍生-液相色譜檢測方法

2.2.1 衍生劑選擇與衍生方法的設定

OPA衍生劑在2-巰基乙醇存在下與第一級氨基酸迅速反應聲稱1-硫代-2-烷基異吲哚，加成物經熒光檢測器測定[11]。苯異硫氰酸酯衍生劑與一、二級氨基酸反應，反應產物在原來氨基酸結構上引入苯環，使得能夠用熒光檢測器檢測[12]。但是PITC衍生時需要真空干燥以出去過量試劑，因此很難全部自動化。相比OPA衍生劑本身不干擾分離與檢測，不必除去過量試劑，色譜圖基線比較平穩[13]。基于以上考慮，本方法中甘氨酸的測定采取OPA柱前衍生法。

樣品自動柱前衍生程序為抽取樣品5.0μL、沖洗進樣針端口5.0s、抽取衍生液5.0μL、沖洗進樣針端口5.0s、混合30次(混合時間為2min左右)進樣(進樣量為10μL)。

樣品手動柱前衍生程序：用移液器準確移取樣品濾液0.5mL于2mL的棕色自動進樣瓶中，再準確加入0.5mL OPA衍生試劑，反應1min后，立即進樣。

2.2.2 色譜條件的優化

流動相中乙酸銨溶液和甲醇的配制比例對甘氨酸的出峰時間和分離效果均有直接影響，這一比例的最終確定根據樣品分離過程中甘氨酸與其他氨基酸峰完全分離為主要因素，其次選擇適合的分離時間。根據表1選擇乙酸銨、乙腈和甲醇的不同比例進行測定，最終選擇流動相：A為0.02mol/L乙酸銨溶液65%，B為25%乙腈，C為10%甲醇，測定出峰時間在7min左右。

表1 流動相選擇Table 1 Selection of optimal mobile phase composition

2.2.3 標準曲線

1g/L甘氨酸標準儲備液。甘氨酸標準工作液：將儲備液稀釋配成質量濃度為0、1、5、10、15、20mg/L的標準工作曲線，分別進行高效液相色譜分析。

2.2.4 方法檢測限

在基質中加標，逐級稀釋以3倍的信噪比確定檢出限為1μg/g。

2.2.5 方法的回收率和精密度

準確稱取同一種空白樣品6份，每份5.00mL，共2組，分別定量加入甘氨酸標準溶液，添加量分別為100mg/L和200mg/L，按上述本方法樣品處理、色譜條件及定性定量方法操作計算，回收率及精密度見表2。從表2可看出，不同樣品平均加標回收率94.6%～101.4%，平均相對標準偏差為0.94%～1.79%(n＝6)。

表2 樣品加標回收率與精密度實驗相對標準偏差(n=6)Table 2 Recovery rates and RSDs for glycine determination in spiked samples (n=6)

2.3 氨基酸分析儀測定方法

氨基酸分析儀是通過離子交換色譜法分離具有共性而又有差別的各種氨基酸混合物分離進行定量。甘氨酸與大多數蛋白質氨基酸一樣，具有與水合茚三酮產生顯色反應，生成藍紫色化合物，在570nm處有最大吸收[14]。

依據GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》方法[15]。采用準確吸取0.200mL混合氨基酸標準，用pH2.2的緩沖液稀釋到5mL，此標準稀釋液濃度為5.00nmol/50μL，作為上機測定用的氨基酸標準，用氨基酸自動分析儀以外標法測定試樣測定液的甘氨酸含量。方法檢測限為10pmol。

2.4 實際樣品測定

2.4.1 液相色譜法測定甘氨酸

圖1 標準樣品的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatogram of standard sample

圖1顯示，甘氨酸標準樣品經OPA衍生后測定，出峰時間再7.573min，圖2液體乳樣品的測定顯示，甘氨酸衍生物出峰時間在7.581min，出峰前后無其他氨基酸衍生物干擾，此方法可用作甘氨酸定性及定量的測定方法。

圖2 液體乳樣品中甘氨酸的液相色譜圖Fig.2 Liquid chromatogram of milk sample

2.4.2 氨基酸分析儀法測定甘氨酸

圖3 氨基酸標準混合液測定圖Fig.3 Results obtained for determination of mixed amino acid standard samples by amino acid analyzer

由圖3可見，測定的是氨基酸標準混合液，甘氨酸出峰時間在10.37min，圖4中，第5個峰為液體乳樣品中甘氨酸峰，出峰時間在10.41min，甘氨酸后面峰為丙氨酸，分離較好，出峰無干擾。

圖4 液體乳樣品中氨基酸測定圖Fig.4 Results obtained for determination of amino acids in liquid milk sample by amino acid analyzer

3 結 論

OPA柱前衍生-HPLC法測定液體乳、含乳飲料等產品中游離甘氨酸的含量，具有方法簡單反應快、靈敏，過量試劑不干擾檢測，不必除去，紫外、熒光均可檢測。缺點是反應產物不穩定，需要在線分析，但是目前行業中應用的液相色譜分析儀，基本都具有在線自動衍生功能，鑒于液相色譜儀的普及面廣，因此，此方法更易于推廣和應用。

利用氨基酸分析儀分析法能準確地測定液體乳、含乳飲料等產品中游離甘氨酸的含量，該方法樣品處理簡便易操作，可以對甘氨酸直接進行分析，避免了衍生產物的多樣性，而且無需判斷降解物的來源，也不涉及樣品中氨基酸衍生不徹底等問題，能快速、準確地判斷含乳飲料中是否添加了游離甘氨酸。

因此，在液體乳、含乳飲料等產品的甘氨酸測定應用中，兩種方法均可采用，并且可作為互相驗證的方法。

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Comparative Study of Determination Methods for Glycine in Foods

LIU Xiao-li
(National Food Quality & Safety Supervision and Inspection Center, Beijing 100094, China)

Glycine, as a non-essential amino acid in the human body, has the simplest structure among amino acid series. Glycine is widely used as a food additive with the maximum level of 1.0 g/kg in the food industry. Recent years, industrial grade glycine is illegally used in food products to substitute milk or improve protein content. In this paper, an HPLC method was established for the determination of glycine and compared with the amino acid analyzer method. Meanwhile, glycine contents in commercial milk, milk drink and plant protein products were determined by the HPLC method and the amino acid analyzer method. The results indicated that the amino acid analyzer method had advantages of stable and accurate results, low detection limit and simple operation procedures, while the HPLC method had the advantages of time saving and enough low detection limit compared with the routine fluorescence detection. Therefore, both methods can be applied for practical determination of glycine in food products as mutual authentication methods.

glycine；HPLC；amino acid analysis

TS252.7

A

1002-6630(2012)18-0254-04

2011-06-28

劉小力(1980—)，女，高級工程師，碩士，研究方向為食品安全。E-mail：frida.liu@cfqs.org