反相高效液相色譜法測(cè)定石榴籽中鞣花酸的含量

劉振平，陳祥貴*，彭海燕，楊文宇，何宇新，楊 瀟，李玉鋒

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039)

反相高效液相色譜法測(cè)定石榴籽中鞣花酸的含量

劉振平，陳祥貴*，彭海燕，楊文宇，何宇新，楊 瀟，李玉鋒

(西華大學(xué)生物工程學(xué)院，食品生物技術(shù)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610039)

目的：建立檢測(cè)石榴籽中鞣花酸的含量測(cè)定方法。方法：采用反相高效液相色譜法，Arcus EP-C18(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以甲醇-0.1% TFA溶液為流動(dòng)相梯度洗脫，流速1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。結(jié)果：鞣花酸0.004～0.064μg之間線性關(guān)系良好，平均加樣回收率為100.49%。結(jié)論：本方法精密可靠，可作為檢測(cè)石榴籽中鞣花酸含量的方法。

石榴籽；鞣花酸；反相高效液相色譜法

石榴(Punica granatumL.)在我國(guó)多個(gè)地區(qū)廣泛種植，是一種藥食兩用的植物資源。石榴各部位含有多種功能性成分，具有廣泛的藥理活性。石榴籽作為石榴的重要部位，其含的多酚是一種強(qiáng)的抗氧化劑，國(guó)內(nèi)外大量的研究表明石榴鞣質(zhì)在預(yù)防和治療心腦血管疾病、腫瘤、糖尿病等方面具有顯著效果[1]。近幾年來(lái)，“多酚”類保健品在保健品行業(yè)越發(fā)受到人們關(guān)注[2]，石榴籽含有豐富的多酚類成分，有研究表明石榴籽多酚提取物的抗氧化作用強(qiáng)于VE[3]，因此對(duì)其保健價(jià)值的開發(fā)也具有十分重要的意義。目前大多數(shù)研究和實(shí)踐中主要測(cè)定石榴籽總多酚，少有對(duì)特異性和特征性成分進(jìn)行測(cè)定，尚未見到檢測(cè)石榴籽中特定酚類成分的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用反相高效液相色譜法(reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC)，建立檢測(cè)石榴籽中鞣花酸(ellagic acid)的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮石榴，產(chǎn)地四川西昌市；鞣花酸對(duì)照品(純度≥98%) 山東中藥化學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品工程技術(shù)研究中心；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；所用水均為Milli-Q超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AB高效液相色譜系統(tǒng)(SPD-M20A紫外檢測(cè)器)日本島津公司；Mnli-Q Biocel超純水系統(tǒng)美國(guó) Millipore公司；JJ1004小型超聲波清洗器 東莞市嘉勁機(jī)械有限公司；BS 200S萬(wàn)分之一電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Arcus EP- C18(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：甲醇(A)，0.1%三氟乙酸(TFA)溶液(B)，梯度洗脫條件：0～10min，B 95%～85%；10～16min，B 85%；16～16.5min，B 85%～60%；16.5～36.5min，B 60%；36.5～37min，B 60%～95%；37～45min，B 95%；柱溫：35℃；流速：1.0mL/min；進(jìn)樣量：10μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm。在此色譜條件下，鞣花酸特征峰峰型良好，其色譜圖如圖1所示。

圖1 鞣花酸對(duì)照品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ellagic acid standard

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取鞣花酸對(duì)照品適量溶于甲醇，制成40μg/mL的溶液，取上述對(duì)照品溶液100μL稀釋至1mL作為對(duì)照品溶液，其中鞣花酸質(zhì)量濃度為4μg/mL，備用。

1.3.3 待測(cè)樣品的提取

將新鮮石榴去皮去汁，收集石榴籽，常溫條件下干燥。將干燥的石榴籽粉碎，過(guò)60目篩，參考文獻(xiàn)[4]提取方法：取石榴籽粉末2 g，加入甲醇、乙醇、丙酮和水各10mL超聲提取30min；取上清液10000r/min離心3min后再取上清液，備用。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察

取1.3.2節(jié)制備的對(duì)照品溶液分別進(jìn)樣1、2、4、6、8、1 2、1 6μL。以進(jìn)樣量/μg為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程分別為：y＝11252.7x－10821.7，r＝0.9995；鞣花酸進(jìn)樣量在0.004～0.064μg之間與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

連續(xù)進(jìn)樣樣品溶液5次，每次進(jìn)樣量為10μL，得鞣花酸的峰面積的RSD為2.398%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取樣品溶液按上述色譜條件分別在(0、3、6、9、16)h進(jìn)樣，進(jìn)樣量為10μL，計(jì)算得鞣花酸的峰面積的RSD為1.352%，說(shuō)明樣品在16h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取石榴籽粉末5份按1.3.3節(jié)方法平行制取供試品溶液并測(cè)定，鞣花酸峰面積的RSD為0.845%，重復(fù)性良好。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取適量鞣花酸對(duì)照品，取已知質(zhì)量濃度(含鞣花酸36.00μg/g)的供試品6份，加入適量對(duì)照品。按照1.3.1節(jié)方法測(cè)定，計(jì)算鞣花酸的回收率為100.49%，RSD為2.816%。

2.6 樣品含量測(cè)定

按照1.3.3節(jié)方法提取后，進(jìn)樣，色譜圖如圖2所示。結(jié)果表明，鞣花酸能很好地與其他成分分離，分離度大于1.5，鞣花酸的含量為36.82μg/g。

圖2 樣品高效液相色譜圖Fig.2 HPLC analysis of the extract from pomegranate seeds

3 討 論

圖3 石榴皮鞣素、安石榴苷、鞣花酸對(duì)照品高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of a mixture of punicalin, punicalagin and ellagic acid standard samples at a ratio of 1:3:1

多酚類成分是石榴藥用及保健價(jià)值的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，一般認(rèn)為以鞣花酸為代表。因此，相對(duì)于其他多酚類成分，鞣花酸的藥理學(xué)、提取和檢測(cè)方法的研究報(bào)道要多得多。研究表明，眾多多酚類成分中，人口服后只有鞣花酸可以直接被人體吸收利用[5]。已有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了檢測(cè)石榴皮中鞣花酸的高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法[6-7]。Jimenez等[8]通過(guò)研究認(rèn)為以安石榴苷是石榴皮多酚類成分的主體，其含量遠(yuǎn)高于鞣花酸和石榴皮鞣素，但是，由于石榴部位的不同各多酚類成分的含量可能具有較大的變化。對(duì)石榴籽中總多酚含量的測(cè)定[9]已有報(bào)道，但尚未見到關(guān)于石榴籽中特定多酚類成分檢測(cè)的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)石榴籽中鞣花酸的定量方法對(duì)石榴籽的開發(fā)及質(zhì)量評(píng)價(jià)具有一定的參考意義。結(jié)果表明，石榴籽中鞣花酸的含量約為3.6%。如圖2、3所示，樣品中的石榴皮鞣素和安石榴苷在與對(duì)照品相同的保留時(shí)間處高效液相色譜分析系統(tǒng)未能檢測(cè)到石榴皮鞣素和安石榴苷的特征峰，由此可以表明，石榴籽中石榴皮鞣素和安石榴苷的含量遠(yuǎn)低于鞣花酸或者石榴籽中根本不含有石榴皮鞣素和安石榴苷。因此，可以繼續(xù)從探索石榴籽中是否含有石榴皮鞣素和安石榴苷甚至更多其他多酚類成分及其定量方法上做進(jìn)一步研究。

流動(dòng)相的選擇是建立HPLC方法的關(guān)鍵。石榴籽樣品中成分復(fù)雜，與待檢成分性質(zhì)相似者較多，這些特點(diǎn)都給本檢測(cè)方法的建立帶來(lái)了挑戰(zhàn)。參考多種石榴多酚類成分檢測(cè)方法，如李海霞等[10]檢測(cè)石榴皮中安石榴苷的方法等。最后采用Zhou Hongtao等[11]報(bào)道的關(guān)于對(duì)石榴皮中石榴皮鞣素的分離與純化以及Lu Jingjing[12]等報(bào)道的對(duì)石榴皮中安石榴苷的分離與純化方法中流動(dòng)相甲醇-三氟乙酸(TFA)(0.1%)，通過(guò)優(yōu)化調(diào)整，建立了能很好的將待檢測(cè)成分分離的色譜條件。

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Determination of Ellagic Acid in Pomegranate Seeds by RP-HPLC

LIU Zhen-ping，CHEN Xiang-gui*，PENG Hai-yan，YANG Wen-yu，HE Yu-xin，YANG Xiao，LI Yu-feng
(Key Laboratory of Food Biotechnology of Sichuan Provincial University, School of Bioengineering,Xihua University, Chengdu 610039, China)

Objective: To establish an HPLC method for the determination of ellagic acid in pomegranate seeds. Methods: The chromatographic separation was carried out on an Arcus EP-C18 column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) using a mobile phase composed of a mixture of methanol and 0.1% TFA at a flow rate of 1.0 mL/min by gradient elution. The detection wavelength was 254 nm.Results: The linear range was 0.004－0.064 μg for ellagic acid. The average recovery rate was 100.49%. Conclusion: This method is accurate, reproducible and applicable for quality control of ellagic acid in pomegranate seeds.

pomegranate seedsl；ellagic acid；RP-HPLC

R917

A

1002-6630(2012)18-0220-03

2011-07-12

國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目(2010GA810002)；四川省科技攻關(guān)項(xiàng)目(05SG011-021)

劉振平(1986—)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物與營(yíng)養(yǎng)保健。 E-mail：nping305@126.com

*通信作者：陳祥貴(1967—)，男，教授，博士后，研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與生物技術(shù)。E-mail：chenxianggui@tom.com