HPLC-ESI-MS/MS檢測河豚魚中5種抗生素殘留的方法

田 豐，王 飛，呂 鵬，閆樹峰，廉 力

(1.黑河出入境檢驗檢疫局，黑龍江 黑河 164300；2.秦皇島出入境檢驗檢疫局，河北 秦皇島 066004)

HPLC-ESI-MS/MS檢測河豚魚中5種抗生素殘留的方法

田 豐1，王 飛2，呂 鵬1，閆樹峰1，廉 力1

(1.黑河出入境檢驗檢疫局，黑龍江 黑河 164300；2.秦皇島出入境檢驗檢疫局，河北 秦皇島 066004)

建立一種同時測定河豚魚中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素5種大環(huán)內酯類抗生素殘留的方法。試樣中殘留的抗生素用Tris緩沖溶液提取，經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化后，用液相色譜-質譜/質譜儀檢測和確證，內標法定量。結果表明：5種大環(huán)內酯類抗生素在0.002～0.050μg/mL范圍內均呈線性關系，相關系數(shù)r為0.9977～1.0000；在0.002～0.010mg/kg范圍內，樣品平均加標回收率在78.9%～109.0%之間，重復性相對標準偏差在1.3%～5.3%之間，再現(xiàn)性相對標準偏差在5.2%～14.5%之間，5種大環(huán)內酯類抗生素定量限均為2.0μg/kg。

液相色譜-質譜/質譜；固相萃取；大環(huán)內酯抗生素；河豚魚

河豚魚營養(yǎng)豐富、肉質鮮美，被譽為“魚中之王”。我國河豚魚產(chǎn)品主要銷往日、韓等國際市場。我國的河豚魚以養(yǎng)殖為主，而在養(yǎng)殖過程中不可避免地使用抗生素類藥物。其中主要為大環(huán)內酯類的林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素等。該類抗生素以一個大環(huán)內酯通過羥基以苷鍵與1～3個去氧氨基糖或二甲氨基糖縮合成堿性苷，有較強的抗菌活性[1]，曾廣泛地應用于食用動物作為預防和治療用藥，通常采用飼料或者注射方式，易在食用肉中殘留，并通過食物鏈進入人體。該類藥物對人體的不良反應主要是導致茶堿血濃度升高而致中毒、對前庭和耳蝸神經(jīng)的損害，嚴重者造成肝腎損害，甚至死亡。因此，各國對大環(huán)內酯類抗生素藥物殘留均有嚴格的限量要求，歐盟已禁用，我國也有相應的要求[2-3]。近年來，日韓等國針對該類藥物殘留相繼建立貿(mào)易技術壁壘，限制和排斥中國河豚魚出口。因此，建立一種高靈敏度的測定河豚魚中大環(huán)內酯類抗生素的檢測方法，對于攻破貿(mào)易技術壁壘，是十分必要和緊迫的。

測定大環(huán)內酯類抗生素主要分析方法有微生物法[4-5]、熒光光度法[6]、紫外分光光度法[7-8]、薄層色譜法[9-10]、高效液相色譜法[11-12]、毛細管電泳法[13](capillary electro phoresis，CE)和液相色譜-質譜(liquid chromatographymass spectrometry，LC-MS)聯(lián)用法[14-16]等。在近期的文獻報道中，測定大環(huán)內酯類殘留，樣品前處理大多采用緩沖溶液提取[17-18]結合固相萃取技術分析技術[19-21]，檢測主要采用液相色譜-串聯(lián)質譜方法，該方法靈敏度高、選擇性和特異性好，能夠對低濃度的樣品進行很好的定性確認。文獻報道的測定大環(huán)內酯類分析方法多應用于食品[16-18,22-23]和動物產(chǎn)品[24]，未見與河豚魚相關的檢測研究。

本方法在參考以上文獻的基礎上，擬建立用Tris緩沖溶液提取殘留物，固相萃取(solid phase extraction，SPE)萃取、凈化，內標法液相色譜-質譜/質譜(high performance liquid chromatography，HPLC-MS/MS)檢測河豚魚中5種大環(huán)內酯類抗生素殘留的新方法，填補河豚魚進出口檢測要求的空白。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈均為色譜純；乙酸銨、鹽酸、三羥甲基氨基甲烷、氯化鈣均為分析純；水為GB/T 6682—2008《分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法》規(guī)定的一級水；標準物質(純度≥95%)：林可霉素(lincomycin，CAS號：7179-49-9)、竹桃霉素(oleandomycin，CAS號：7060-74-4)、紅霉素(erythromycin，CAS號：59319-72-1)、替米考星(tilmicosin，CAS號：108050-54-0)、泰樂菌素(tylosin、CAS號：74610-55-2)、內標物質羅紅霉素(roxithromycin，CAS號：80214-83-1)；0.2μm濾膜；Oasis HLB固相萃取柱(500mg，6mL。使用前依次用10mL甲醇和10mL水活化)。

Tris溶液：依次稱取12.0g三羥甲基氨基甲烷和7.35g CaCl2·2H2O溶解于1000mL水中，用鹽酸調節(jié)pH值為9，定容至1000mL。

大環(huán)內酯類抗生素標準儲備溶液：精確稱取適量大環(huán)內酯類抗生素標準品和內標物質羅紅霉素，用乙腈溶解并定容至100mL棕色容量瓶中，得質量濃度為100μg/mL的標準儲備溶液。

混合標準中間溶液：精確吸取大環(huán)內酯類抗生素的標準儲備溶液各1.0mL于10mL容量瓶中，用乙腈稀釋成質量濃度為10.0μg/mL的混合標準中間溶液。

混合標準工作溶液：根據(jù)需要使用前用空白樣品基質配成羅紅霉素質量濃度200ng/mL，林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素分別為2.0、4.0、10.0、50.0ng/mL的4個質量濃度水平的系列基質標準混合工作溶液。

1.2 儀器與設備

AB 3200 Q TRAP液相色譜-質譜/質譜儀[配有電子電離(electron ionization，EI)源] 美國Waters公司；旋渦混合器；氮吹儀；高速離心機(12000r/min)；pH計；振蕩器。

1.3 分析條件

氣相色譜操作條件：色譜柱：Atlantis C18(150mm× 2.1mm，3μm)。流動相A為乙腈，流動相B為0.1% (V/V)甲酸溶液，流動相C為甲醇；流速為0.2mL/min；柱溫30℃；進樣量20μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 HPLC分析梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

質譜掃描參考條件：離子源為電噴霧離子源；掃描方式為正離子掃描；檢測方式為多反應監(jiān)測；電噴霧電壓5500V；霧化氣壓力0.24MPa；輔助氣流速0.4L/ min；離子源溫度550℃；碰撞室出口電壓2.0V；定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓條件見表2。

表2林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素定性離子對、定量離子對、碰撞能量和去簇電壓Table 2 Qualitative ions, quantitative ions, collision energy and cluster voltages for lincomycin, oleandomycin, erythromycin, tilmicosin and tylosin

1.4 實驗方法

待檢成分提取：稱取5g(精確至0.01g)試樣，置于50mL離心管中，加入20.0μL質量濃度為10ng/mL的內標工作溶液和10.0mL Tris溶液，于振蕩器上劇烈振蕩10min。以12000r/min轉速離心10min，取上清液以小于1.0mL/min的流速通過已活化的Oasis HLB固相萃取柱；再加入10.0mL Tris溶液，于振蕩器上按前述步驟重復萃取1次，取上清液相同條件過萃取柱。

待檢成分純化：待樣液全部流出后，先后用10mL水和10mL甲醇溶液(2:3，V/V)洗柱，棄去全部流出液，將固相萃取柱用真空泵抽干。然后用10mL甲醇洗脫于15mL離心管中，用氮氣濃縮儀于50℃水浴中吹干，準確加入1.0mL 0.01mol/L乙酸銨溶液-乙腈(17:3，V/V)溶液溶解并定容，于超聲波儀中超聲波助溶約1min。溶液過0.2μm濾膜后，供液相色譜-串聯(lián)質譜儀測定。

2 結果與分析

2.1 提取溶液的選擇

根據(jù)相關文獻資料，從動物組織中提取大環(huán)內酯類藥物的主要提取溶液有磷酸鹽緩沖溶液、0.3%偏磷酸-甲醇溶液、乙腈、Tris溶液和乙酸鹽溶液，本實驗對此進行對比實驗，結果見表3。

表3 不同提取溶液的提取效果Table 3 Comparison of the extraction efficiency of five marcolide antibiotics with different extraction solvents

從表3可以看出，當用0.1mol/L磷酸鹽緩沖溶液作為提取液時，5種大環(huán)內酯類抗生素的回收率為0.0%～153.0%；當用0.3%偏磷酸-甲醇溶液(7:3，V/V)作為提取液時，林可霉素的回收率為1.8%，紅霉素的回收率非常不穩(wěn)定(30.0%～106.0%)，其他大環(huán)內酯類抗生素的回收率回收率為72.0%～106.0%；當用乙腈作為提取液時，除竹桃霉素、泰樂菌素的回收率大于7 0%外，其他大環(huán)內酯類抗生素的回收率均小于31.4%；當用0.1mol/L乙酸鹽溶液作為提取液時，替米考星的回收率小于7 0%，其他大環(huán)內酯類抗生素的回收率均大于70%；當用Tris溶液作為提取液時，5種大環(huán)內酯類抗生素的回收率在78.4%～99.1%范圍。所以本方法采用Tris溶液作為提取液。

2.2 不同固相萃取柱對回收率的影響

在選定條件下，對Varian C18、Oasis HLB(500g)、Oasis HLB(200g)、MCX和Bakerbond spe C18五種固相萃取柱的效率進行比較，結果見表4。

表4 不同固相萃取柱對回收率的影響Table 4 Effects of different solid phase columns on recovery rate

結果表明，Oasis HLB(500g)固相萃取柱的效果最理想。因此，本方法選擇Oasis HLB(500g)固相萃取柱為凈化柱。

2.3 內標的選擇

根據(jù)相關文獻資料記載，大環(huán)內酯測定的內標物選擇主要有羅紅霉素和林可霉素，對比實驗結果見表5。

表5 不同內標物的選擇Table 5 Selection of optimal internal standard

從表5可以看出，當用林可霉素為內標時，只有替米考星的回收率在94.2%，其余的回收率在94.2%～277.0%之間；當用羅紅霉素為內標時，5種大環(huán)內酯類抗生素的回收率在76.5%～117.0%范圍。所以本方法采用羅紅霉素作為內標。

2.4 參考保留時間

用系列基質混合標準工作溶液，分別進樣。在儀器最佳工作條件下，以基質混合標準工作溶液濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，用標準工作曲線對樣品進行定量。樣品溶液中，5種大環(huán)內酯類抗生素的響應值均應在儀器測定的線性范圍內。在上述色譜條件和質譜條件下，林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素的參考保留時間分別為6.96、7.36、8.06、8.36、8.48min。

圖1 5種抗生素的基質標準定量限(a)、定量限添加(b)和空白樣品(c)的MRM圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatogram of 5 antibiotics in matrix standard at the level of LOQ(a), spiked samples at the level of LOQ (b) and blank samples (c)

2.5 線性范圍和定量限

配制2.0、4.0、10.0、50.0ng/mL四個質量濃度水平的系列基質標準混合工作溶液，在選定的條件下進行測定，進樣量為20μL，用峰高對標準溶液中各被測組分的質量濃度做圖。林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素的絕對量在0.04～1.0ng范圍內均呈線性關系，其線性方程和相關系數(shù)見表6。

表6 5種大環(huán)內酯類抗生素線性方程和相關系數(shù)Table 6 Linear equations and correlation coefficients of 5 macrolide antibiotics

5種大環(huán)內酯類抗生素在添加水平2.0～50μg/kg范圍時，響應值在儀器線性范圍之內，信噪比RSN大于5。林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素的基質標準定量限(limit of quantity，LOQ)、定量限添加和空白樣品檢測的多反應檢測(multiple reaction monitoring，MRM)圖見圖1。

根據(jù)最終樣液所代表的試樣量、定容體積、進樣量和進行測定時所受的干擾情況，確定本方法測定河豚魚中的林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素的定量限為2.0μg/kg。

2.6 方法的回收率和精密度

用不含該5種大環(huán)內酯類抗生素的河豚魚樣品進行添加回收和精密度實驗，樣品中添加2.0、4.0、8.0、10.0μg/kg四個不同水平標準后，搖勻，然后按本方法進行提取、凈化、測定。5種大環(huán)內酯類抗生素的回收率數(shù)據(jù)全部在78.9%～109.0%之間，4個水平相對標準偏差小于等于14.17%，說明方法的回收率和精密度良好。5種大環(huán)內酯類抗生素出峰區(qū)域未見干擾峰，空白樣品實驗也表明，對于河豚魚樣品，本方法的適用性良好。

2.7 方法的實驗室驗證

本方法經(jīng)8個實驗室進行重復性和再現(xiàn)性驗證。用不含5種大環(huán)內酯類抗生素的河豚魚樣品分別做2.0、4.0、8.0、20.0μg/kg四個不同水平的添加回收實驗，5種大環(huán)內酯類抗生素重復性相對標準偏差在1.3%～5.3%之間，再現(xiàn)性相對標準偏差在5.2%～14.5%之間，均符合國際上通用的AOAC標準分析方法對國際協(xié)同研究實驗室內與實驗室間重復性相對標準偏差和再現(xiàn)性相對標準偏差之要求。

3 結 論

本實驗建立了HPLC-ESI-MS/MS同時測定河豚魚中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星和泰樂菌素殘留量的檢測方法，方法的重復性相對標準偏差、再現(xiàn)性相對標準偏差均符合國際上通用的AOAC標準分析方法要求，操作簡單、回收率穩(wěn)定、靈敏度高、選擇性好、定量同時可以定性。河豚魚中的5種大環(huán)內酯類抗生素定量限達到2.0ΜG/KG，達到實驗設計目的，完全滿足世界各國對該類藥物殘留限量的檢測要求，可以應用在進出口河豚魚檢測中。

[1] 李巖, 邵兵, 徐鎖洪. 動物性食品中大環(huán)內酯類抗生素殘留分析[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2005, 10(15): 1273-1277.

[2] 王煉, 楊元, 高玲, 等. 動物性食品中11種獸藥殘留的高效液相色譜(HPLC)法測定[J]. 中國衛(wèi)生檢驗雜志, 2004, 14(3): 276-2781.

[3] 農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)牧發(fā)(1999)第17號 關于發(fā)布《動物性食品中獸藥最高殘留限量》的通知[B]. 1997-09-01.

[4] 王實, 夏書月, 王魯寧, 等. 阿奇霉素在肺炎患者支氣管灌洗液中的濃度測定[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 1999, 19(8): 457-458.

[5] 姜敏, 戴群, 傅穎君, 等. 國產(chǎn)阿奇霉素人體藥代動力學及生物等效性研究[J]. 江西醫(yī)學院學報, 1999, 39(3): 25-28.

[6] 李平. 硫酸呈色-分光光度法測定紅霉素片的溶出度[J]. 齊齊哈爾醫(yī)學院學報, 2002, 23(9): 1068-1069.

[7] 湯玖安, 劉興蘭. 乙酰吉他霉素含片含量均勻度方法研究[J]. 藥物分析雜志, 1999, 19(5): 342-343.

[8] 晏敏紅, 俞麗君, 周建忠. 紫外分光光度法測定琥乙紅霉素顆粒劑的含量[J]. 中國藥業(yè), 2003, 12(1): 42.

[9] 魏振平, 畢殿洲. 比色法、薄層色譜法及高效液相色譜法在羅紅霉素溶液穩(wěn)定性研究中的比較[J]. 中國藥學, 2000, 9(4): 202-207.

[10] 周志凌, 冷智生, 金建平, 等. 十四元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素薄層鑒別方法研究[J]. 中國藥事, 2004, 18(7): 437-438.

[11] 史岑, 董家文. 體內大環(huán)內酯類抗生素的藥物分析方法[J]. 中國醫(yī)院藥學雜志, 2001, 21(3): 169-171.

[12] 夏敏. 液相色譜-質譜法同時檢測畜禽肉中5種大環(huán)內酯抗生素[J].分析測試學報, 2004, 23(1): 217-2191.

[13] 胡昌勤, 尹利輝. 毛細管電泳及其在抗生素分析中的應用[J]. 國外醫(yī)藥: 抗生素分冊, 2000, 9(21): 193-197.

[14] 史向國, 鐘大放. 液相色譜-質譜聯(lián)用法鑒定必特螺旋霉素中多組分[J]. 質譜學報, 2003, 4(24): 460-463.

[15] 田蕾, 鐘大放. HPLC-ECD與HPLC-MS聯(lián)用測定人尿樣中的羅紅霉素及其代謝物[J]. 中國藥學雜志, 1999, 34(5): 318-321.

[16] DUBOIS M, FLUCHARD D, SIOR E, et al. Identification and quantification of five macrolide antibiotics in several tissues, eggs and milk by liquid chromatography electrospray tandem mass spectrometry[J]. Jorunal of Chromatography B, 2001, 753(2): 189-202.

[17] JUHEL-GAUGAIN M, ANGER B, LAURENTIE M. Multiresidue chromatographic method for the determination of macrolide residues in muscle by high-performance liquid chromatography with UV detection[J]. J AOAC Int, 1999, 82(5): 1046-1053.

[18] DUBOIS M, FLUCHARD D, SIOR E, et al. Determination of macrolide antibiotics by liquid chromatography[J]. J Chromatogr A, 2001, 910(2): 285-290.

[19] HORIE M, TAKEGAMI H, TOYA K, et al. Determination of macrolide antibiotics in meat and fish by liquid chromatography-electrospray mass spectrometry[J]. Anal Chim Acta, 2003, 492(1/2): 187-197.

[20] HORIE M, SAITO K, ISHII R, et al. Simultaneous determination of five macrolide antibiotics in meat by high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr A, 1998, 812(1/2): 295-302.

[21] KANEKO S, KOIZUMI I, ASIDA K, et al. An analytical study of antibacterial residues in meat: the simultaneous determination of 23 antibiotics and 13 drugs using gas chromatography[J]. Vet Hum Toxicol, 1992, 34(5): 393-397.

[22] PRATS C, FRANCESCH R, ARBOIX M, et al. Determination of tylosin residues in different animal tissues by high performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr B, 2001, 766(1): 57-65.

[23] MORAN J W, TURNER J M, COLEMAN M R. Determination of tilmicosin in bovine and porcine sera by liquid chromatography[J]. J AOAC Int, 1997, 80(6): 1183-1189.

[24] 國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局. GB/T 20762—2006 畜禽肉中林可霉素、竹桃霉素、紅霉素、替米考星、泰樂菌素、克林霉素、螺旋霉素、吉它霉素、交沙霉素殘留量的測定方法: 液相色譜-串聯(lián)質譜[M]. 北京: 中國標準出版社, 2006.

Determination of 5 Macrolide Antibiotics in Pufferfish Meat by HPLC-ESI-MS/MS

TIAN Feng1，WANG Fei2，LU Peng1，YAN Shu-feng1，LIAN Li1
(1. Heihe Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Heihe 164300, China；2. Qinhuangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Qinhuangdao 066004, China)

A method has been developed for the simultaneous determination of five marcolide antibiotic residues including lincomycin, oleandomycin, erythromycin, tilmicosin and tylosin in pufferfish meat. Five antibiotic residues in samples were extracted into Tris buffer. The extract was cleaned up on an Oasis HLB column. The antibiotic residues were determined and confirmed by LC-MS/MS and quantified by an internal standard method. The calibration curves of 5 antibiotics exhibited good linearity in the concentration range of 0.002－0.050μg/mL with a correlation coefficient range of 0.9977－1.0000. The average recovery rates of the marcolide antibiotics from pufferfish samples at spike levels of 0.002－0.010 mg/kg was 78.9%－109.0% with a relative standard deviation of 1.3%－5.3% for repeatability and with a relative standard deviation of 5.2%－14.5% for reproducibility. The detection limit was 2.0μg/kg for these 5 antibiotics.

high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)；solid phase extraction (SPE)；macrolide antibiotics；pufferfish

TS207.3；O657.63

A

1002-6630(2012)18-0206-05

2011-07-28

田豐(1 97 0—)，女，高級工程師，學士，主要從事食品、農(nóng)副產(chǎn)品中農(nóng)、獸藥殘留檢測研究。E-mail：tfhh-8999@163.com