酯交換植物油中甾醇含量快速測定方法的建立

朱秀清，竇巍巍，胡立志，陳 昊，于殿宇，李佳棟

(1.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150050；2.大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司，黑龍江 大慶 163316；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

酯交換植物油中甾醇含量快速測定方法的建立

朱秀清1，竇巍巍2，胡立志1，陳 昊1，于殿宇3，李佳棟1

(1.國家大豆工程技術(shù)研究中心，黑龍江 哈爾濱 150050；2.大慶麥伯康生物技術(shù)有限公司，黑龍江 大慶 163316；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

建立簡單、快速測定酯交換植物油中高含量的植物甾醇的方法。對紫外比色法分析酯交換植物油中的植物甾醇含量進行研究，通過單因素與正交試驗，確定最佳的測量條件為顯色劑用量2mL、顯色劑組成(鐵礬儲備液:濃硫酸)比例2:8、顯色時間30min、顯色溫度20℃。測定結(jié)果與氣相色譜法結(jié)果相比，相對誤差平均偏高2.95%，校正后測定結(jié)果的相對誤差為0.49%。本方法可用于酯交換植物油中甾醇的定量分析，操作簡單、具有良好的準(zhǔn)確性和實用性。

酯交換植物油；紫外比色法；氣相色譜法；植物甾醇；測定

植物甾醇(phyotsterol)，是植物性食物中含有的類膽固醇物質(zhì)，其中植物油中含量最為豐富[1]，是以環(huán)戊烷全氫菲為骨架(又稱甾核)的一類天然活性物質(zhì)，植物甾醇主要來源于植物油、谷物、水果和蔬菜中[2]。植物甾醇被譽為“生命的鑰匙”，具有十分重要的生理價值[3]，如降低血膽固醇、抗癌、抗炎、抗腫瘤、防治心血管疾病等[4-6]。植物甾醇安全性高，研究證明植物甾醇能有效降低血液中膽固醇的水平[7-8]，降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL)的水平，而對高密度脂蛋白膽固醇(HDL)的影響不大[9-11]，可用于預(yù)防治療冠狀動脈粥樣硬化類的心臟病。植物甾醇作為存在于植物細(xì)胞中的一類甾體組分和人類膳食脂質(zhì)中的一類功能性組分，在醫(yī)學(xué)、食品、化工、飼料、植物基因工程等領(lǐng)域引起高度重視與關(guān)注[12]。但游離甾醇在水和油脂中的低溶解性限制了它在食品中的實際應(yīng)用[13]，通過對植物油脂與甾醇進行酯交換反應(yīng)，制備具有較高含量甾醇酯的酯交換植物油，可以有效的解決甾醇在油脂中溶解性低的問題。甾醇酯具有較高的降膽固醇的效果和較好的脂溶性[14]，國外市場已研發(fā)出添加了植物甾醇酯的保健功能食品，例如食用油、黃油、人造奶油等[15-16]，同樣在化妝品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用也比較廣泛[17]。建立一種方便、快捷、準(zhǔn)確的測定植物油中甾醇含量的方法，對含植物甾醇的功能性油脂的開發(fā)和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)起著重要作用。目前尚無測定植物油中植物甾醇含量的國標(biāo)檢測方法，現(xiàn)有的測定方法主要有：毛地黃皂甙法、可見光比色法、薄層色譜法、高效液相色譜法和氣相色譜法(gas chromatography，GC)等[18]。毛地黃皂甙法和薄層色譜法分析甾醇處理過程繁雜、數(shù)據(jù)可靠性較差，已逐漸被淘汰。氣相色譜法和高效液相色譜法具有較好的測量精度，但儀器昂貴，操作要求高、標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴。現(xiàn)有的紫外比色法測定植物甾醇的含量具有樣品用量少，操作方便，但存在測量精度差，不適合檢測油脂中高含量植物甾醇等缺點。

本研究借鑒現(xiàn)有的檢測食品和食用油中甾醇含量的紫外比色分析方法，通過對酯交換技術(shù)制備的甾醇含量較高的植物油進行定性和定量分析研究，建立一種快速測定植物油中植物甾醇含量的紫外比色法，旨在為添加植物甾醇的功能性油脂的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供快捷和簡便的監(jiān)測手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

自制酯交換植物油(植物甾醇含量3%～6%)；植物甾醇(95%) 西安藍(lán)天生物工程有限責(zé)任公司；豆甾醇、β-谷甾醇、角鯊?fù)闃?biāo)準(zhǔn)樣品 美國Sigma公司；石油醚、冰乙酸、硫酸鐵銨等均為分析純。

1.1.2 試劑配制

鐵礬儲備液：溶解4.463g硫酸鐵銨[FeNH4(SO4)2· H2O]于100mL 85%磷酸中，貯于干燥器內(nèi)，于室溫中穩(wěn)定待用。鐵礬顯色液：吸取鐵礬儲備液10mL，用濃硫酸定容至100mL。貯于干燥器內(nèi)。

1.1.3 儀器與設(shè)備

TU-1901雙光束紫外分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；DK-2000-ⅢL數(shù)顯恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；7890A氣相色譜儀(FID檢測器)、HP-5毛細(xì)管柱 (30m×0.32mm，0.25μm) 美國安捷倫公司。

1.2 方法

1.2.1 紫外比色法

1.2.1.1 測定方法

稱取一定量(100～150mg)的酯交換植物油，置于25mL試管內(nèi)，準(zhǔn)確記錄其質(zhì)量，加入KOH-乙醇溶液，恒溫水浴中皂化30～60min。冷卻后加入氯化鈉溶液與石油醚10mL，劇烈振搖數(shù)分鐘后靜置分層。取上層石油醚液2mL，氮氣吹干后，加入冰乙酸與鐵礬顯色液，混勻，放置20～30min后測得吸光度(如濃度過高應(yīng)進行稀釋后測定)，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相應(yīng)的甾醇含量。

1.2.1.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線

依次吸取質(zhì)量濃度為1mg/mL甾醇標(biāo)準(zhǔn)常備液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0mL分別置于10mL試管內(nèi)，在各管內(nèi)加入冰乙酸使總體積皆達(dá)4mL。沿管壁加入2mL鐵礬顯色液，混勻，室溫下顯色20～30min后，于最大吸收波長下測定吸光度。以甾醇標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 氣相色譜法

1.2.2.1 色譜條件

進樣口溫度：300℃；分流比：30:1；柱箱溫度：260℃，F(xiàn)ID檢測器溫度：300℃；載氣：氮氣流速2. 5mL/min恒流，氫氣流速：40mL/min，空氣流速400mL/ min；進樣量：1μL。

1.2.2.2 氣相色譜法測定樣品中甾醇的含量

準(zhǔn)確稱取酯交換植物油150mg，置于250mL錐形瓶中，加無水乙醇10mL，再加入氫氧化鉀3g，加熱回流2h。冷卻后加入20mL去離子水，10mL正己烷，振搖后靜置分層，用10mL正己烷萃取2～3次，合并正己烷萃取液，用去離子水洗至pH值中性，加入適量無水硫酸鈉脫水，濾液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，殘液用正己烷定容至10mL，供氣相色譜檢測。經(jīng)過0.45μm微濾膜過濾后進樣測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外比色法

2.1.1 最大吸收波長

取酯交換植物油樣品適量，進行顯色處理，于320～900nm范圍內(nèi)掃描。最大吸收峰在564nm處，因此，選擇564nm作為測定吸收波長。

2.1.2 甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線

按照1.2.1.2節(jié)方法，得其回歸方程為Y＝2.88947X＋0.00671，R2＝0.9995。線性范圍為0～0.2mg/mL，檢出限為0.007mg/mL，定量限為0.025mg/mL。相關(guān)系數(shù)為正，說明吸光度隨甾醇含量增大而增大，其絕對值接近1，呈較好的正相關(guān)性。

2.1.3 稀釋倍數(shù)的確定

植物油與甾醇酯交換后的油中甾醇的含量較高為3%～6%，不在標(biāo)準(zhǔn)曲線可檢測到的范圍內(nèi)，通過稀釋的方法加以調(diào)整。稀釋倍數(shù)為10倍時，標(biāo)準(zhǔn)偏差(s)為0.001%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation，RSD)為1.09%，為最佳稀釋倍數(shù)。

2.2 顯色反應(yīng)單因素試驗

2.2.1 顯色劑用量對顯色反應(yīng)的影響

稱取一定量(100～150mg)的酯交換植物油，按照1.2.1.1節(jié)測定方法進行前處理，加入鐵礬顯色劑體積分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，15℃反應(yīng)30min，在最大吸收波長下測定吸光度，以確定最佳用量。從圖1可見，當(dāng)顯色劑用量為2.5mL時，紫外掃描圖1在 340nm和564nm處出現(xiàn)兩個波峰，564nm處最大吸收峰較為明顯；當(dāng)顯色劑用量為2.0mL和1.5mL時，紫外掃描曲線2、3的吸光度在20～30min范圍內(nèi)基本保持不變，且顯色劑用量為2.0mL和1.5mL時最大吸收峰較為明顯。從圖2可見，當(dāng)顯色劑用量為2.5mL時，反應(yīng)的吸光度基本保持不變，因此，適宜顯色劑用量為1.5～2.5mL。

圖1 不同顯色劑用量酯交換植物油的吸收譜圖Fig.1 UV spectra of reaction products of transesterified soybean oil and different doses of color developer

圖2 顯色劑用量對顯色反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of color developer dose on reaction

2.2.2 顯色溫度對顯色反應(yīng)的影響

圖3 顯色溫度對顯色反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of color development temperature on reaction

稱取一定量(100～150mg)的酯交換植物油，按照1.2.1.1節(jié)測定方法進行前處理，加入鐵礬顯色劑2.0mL，不同溫度下反應(yīng)30min，以確定最佳顯色溫度。從圖3可見，隨顯色溫度的提高，反應(yīng)的吸光度緩慢增加，但40℃后空白樣品及測定樣品顏色均變深，以同溫度條件下反應(yīng)的空白對照下，測定吸光度變低，可見溫度較高使反應(yīng)不穩(wěn)定。因此，適宜顯色溫度為10～30℃。

2.2.3 顯色時間對顯色反應(yīng)的影響

稱取一定量(100～150mg)的酯交換植物油，按照1.2.1.1節(jié)測定方法進行前處理，15℃反應(yīng)條件下確定最佳顯色時間。從圖4可見，隨顯色時間的延長，反應(yīng)的吸光度呈先升高再緩慢下降的趨勢，在25～35min間，顯色反應(yīng)穩(wěn)定，反應(yīng)的適宜時間為25～35min。

圖4 顯色時間對顯色反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of color development time on reaction

2.2.4 顯色劑(鐵礬儲備液:濃硫酸)組成比例對顯色反應(yīng)的影響

稱取一定量(100～150mg)的酯交換植物油，按照1.2.1.1節(jié)測定方法進行前處理，15℃條件下反應(yīng)30min，確定最佳顯色時間。從圖5可見，隨顯色劑組成中鐵礬儲備液加入量的增加，在564nm處的吸光度呈下降趨勢。組成比例為0.5:9.5時，在340nm和564nm處出現(xiàn)兩個波峰，最大吸收峰出現(xiàn)在340nm處，對測定結(jié)果有影響；在1:9時，在340nm和564nm處出現(xiàn)兩個波峰，最大吸收峰出現(xiàn)在564nm處；在1.5:8.5和2:8時，在340nm處未出現(xiàn)波峰，在564nm處吸光度穩(wěn)定。因此，適宜的顯色劑組成比例選擇為1:9～2:8。

圖5 顯色劑組成比例對顯色反應(yīng)的影響Fig.5 Effect of color developer composition on reaction

2.2.5 紫外比色法顯色條件正交優(yōu)化試驗

選取4個對顯色過程影響較大的因素(即顯色時間、顯色劑用量、顯色劑的組成比例為研究對象，以吸光度為考察指標(biāo)進行正交試驗，其因素水平見表1。由表2可以看出，影響顯色反應(yīng)的因素的主次關(guān)系為顯色劑用量＞顯色劑組成比例＞顯色時間＞顯色溫度。通過以上分析確定最佳反應(yīng)條件為A2B2C3D2，即顯色劑用量2mL，顯色劑組成比例2:8，顯色時間30min，顯色溫度20℃。在最佳反應(yīng)條件下測量結(jié)果與GC法具有較好的一致性，即紫外法4.17%，GC法為4.05%。

表1 紫外比色法顯色反應(yīng)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal tests

表2 紫外比色法顯色反應(yīng)正交試驗結(jié)果及分析Table 2 Results and range analysis of orthogonal tests

2.3 氣相色譜法測定樣品中甾醇的含量

圖6 酯交換大豆油的氣相色譜圖Fig.6 Gas chromatogram of transesterified soybean oil

采用GC法對酯交換大豆油中甾醇進行了定性定量分析，圖6為酯交換大豆油中甾醇的GC圖譜。對照標(biāo)準(zhǔn)樣品GC圖譜，確定酯交換大豆油中的各種甾醇的出峰先后順序為菜籽甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、β-谷甾醇。

2.4 檢測精度的評價

2.4.1 紫外比色法與氣相色譜法測定結(jié)果的比較分析

表3 兩種方法測定結(jié)果的對比分析Table 3 Comparison of the results obtained for phytosterol content in transesterified vegetable oil by colorimetric method and GC method

由表3可以看出，紫外比色法分析結(jié)果略高于氣相色譜法，紫外比色法測定絕對值平均高0.14%，絕對誤差最大為0.21%，平均偏高0.14%，相對誤差最大為3.70%，平均偏高2.95%。差別幅度與甾醇含量不存在關(guān)聯(lián)，紫外比色法測定植物甾醇總含量接近GC測定值。若用平均偏高0.14%作為該法測定后的校正值，則與氣相色譜法測定值分別相差－0.02%、－0.02%、－0.01%、0.01%、－0.02%、－0.08%、0.07%、0.06%，則相對誤差僅為－0.61%、－0.49%、－0.20%、0.17%、－0.55%、－1.81%、1.23%、1.05%。

由表3、4進行分析，采用t檢驗法檢驗兩種方法測定結(jié)果的差異性，計算得：s＝0.048，t＝0.1229，自由度f＝8－1＝7，若α＝0.05時，查t分布表得t表＝2.3646，現(xiàn)t＜t表，說明兩種方法測定結(jié)果沒有顯著性差異。采用F檢驗法檢驗兩種方法的精密度差異，計算得：F＝＝0.04，按自由度f1＝3－1＝2，f2＝5－1＝4，若α＝0.0 5時，查F分布表得，F(xiàn)α(2,4)＝6.94，現(xiàn)F＜F表，說明兩種測定方法的精密度差異不顯著。

表4 兩種方法精密度的對比分析Table 4 Comparative analysis of the precision of colorimetric method and GC method

2.4.2 穩(wěn)定性實驗

取酯交換植物油樣品，分別于5、10、15、20、30、40、50、60min顯色，5～20min吸光度不穩(wěn)定；20～60min吸光度相對穩(wěn)定，其5個時間點吸光度的均值為0.4260，RSD為0.141%，表明供試品溶液在顯色20～60min較穩(wěn)定。

2.4.3 精密度實驗

取酯交換植物油樣品，連續(xù)測定5次，吸光度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.176%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 回收率實驗

采用加樣回收法。取同批酯交換油脂樣品5份，精密量取濃度為5.0mg/mL植物甾醇對照品溶液2mL，分別加入上述5份樣品中。按國標(biāo)鐵礬顯色法處理，加2mL顯色劑，于最大吸收波長處測定吸光度，計算回收率。計算紫外比色法平均回收率為98.61%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.57%，表明加樣回收可滿足要求，測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

表5 回收率測定結(jié)果Table 5 Result of fortified recoveries

3 結(jié) 論

以高含量甾醇的酯交換植物油為檢測對象，探索紫外比色法測定甾醇含量的可行性，與氣相色譜法比較分析表明，測定結(jié)果的精密度較高。相對誤差平均偏高2.95%，校正后測定結(jié)果的相對誤差為0.49%。與現(xiàn)有紫外測定方法測定相比，本方法操作簡單、準(zhǔn)確。該方法可為添加植物甾醇的功能性油脂的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供快捷和簡便的監(jiān)測手段。

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Determination of Pigments in Fruit Hard Candy by Polymer Extraction and Spectrophotometry

ZHU Xiu-qing1，DOU Wei-wei2，HU Li-zhi1，CHEN Hao1，YU Dian-yu3，LI Jia-dong1
(1. National Research Centre of Soybean Engineering and Technology, Harbin 150050, China；2. Daqing Mab Com, Inc, Daqing 163316, China; 3. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China；

Based on the fact that aqueous solution of water-soluble polymers can be separated into two phases upon addition of inorganic salt, pigments in fruit hard candy were transferred into the polymer phase, resulting in reduced interference, and quantitatively determined by single-wavelength or dual-wavelength spectrometry. The results showed that the linear ranges of cochineal, lemon yellow, fancy red, sunset yellow, and bright blue were 0.2-30, 0.2-40, 0.2-35, 0.2-30, and 0.1-10μg/mL, respectively, with correlation coefficient (r2) of larger than 0.997. This method needs only simple equipment and is easy to use, and accurate.

polythene glycol-4000；fruit hard candy; spectrometry；pigment

TS225.1

A

1002-6630(2012)18-0186-05

2011-07-05

黑龍江省科技攻關(guān)項目(WB09B201-1)

朱秀清(1968—)，女，研究員，碩士，主要從事大豆精深加工技術(shù)研究。E-mail：xqzhuwang@163.com