響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須黃酮提取工藝

張 艷，李海濤，周鴻立,*

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須黃酮提取工藝

張 艷1，李海濤2，周鴻立1,*

(1.吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

采用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須黃酮的提取工藝條件。以乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取溫度、提取時(shí)間和料液比為考察因素，黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，獲得多元二次回歸方程；考察玉米須黃酮體內(nèi)抗氧化作用。結(jié)果表明：最佳提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、提取溫度78℃、提取時(shí)間1.7h、料液比1:26(g/mL)，此工藝條件黃酮得率為0.41%。玉米須黃酮能夠降低血清和肝臟中的丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶活力，具有一定的抗氧化能力。

玉米須黃酮；響應(yīng)面；抗氧化

玉米(Zea maysL.)為禾本科玉蜀屬植物，是我國(guó)廣泛種植的傳統(tǒng)農(nóng)作物。玉米須為玉米的花柱和柱頭，是我國(guó)傳統(tǒng)藥食同源的中草藥，為《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥材標(biāo)準(zhǔn)》收錄的常用藥材品種之一。玉米須具有利水消腫、降壓降糖等功效，用于治療水腫、黃疸、高血壓、糖尿病等病癥；含有多種活性成分[1-3]，如黃酮類、多糖類、揮發(fā)油、皂苷等。

響應(yīng)面分析法[4-8]是利用合理的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，通過(guò)試驗(yàn)得到的相關(guān)數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來(lái)擬合因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過(guò)對(duì)回歸方程的分析來(lái)尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問(wèn)題的一種統(tǒng)計(jì)方法。隨著計(jì)算機(jī)的發(fā)展，它已廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、生物、食品、化學(xué)、制造等領(lǐng)域。目前關(guān)于玉米須黃酮提取工藝的報(bào)道[9-13]，多采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，而采用響應(yīng)面法優(yōu)化玉米須黃酮提取工藝尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以玉米須為試驗(yàn)材料，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用四因素三水平的響應(yīng)面分析法，優(yōu)化玉米須黃酮提取的最佳工藝條件，并研究其體內(nèi)抗氧化作用，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用玉米須資源提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須2010年10月采收于吉林省吉林市郊區(qū)，經(jīng)吉林大學(xué)王廣樹(shù)教授鑒定為玉蜀黍玉米(Zea maysL.)的干燥花柱和柱頭，實(shí)驗(yàn)前洗凈、曬干、剪碎、干燥通風(fēng)處保存。

無(wú)水乙醇、三氯化鋁、甲醇均為國(guó)產(chǎn)分析純；丙二醛、超氧化物化酶、考馬斯亮藍(lán)試劑盒 南京建成試劑有限公司；蘆丁對(duì)照品 中國(guó)(長(zhǎng)春)藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；725型紫外光柵分光光度計(jì) 山東高密彩虹分析儀器有限公司；LDZ-5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；FA-2004分析天平 上海精細(xì)科技儀器廠。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，18～22g，合格證號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第scxk-(吉)-2010-0011，由長(zhǎng)春高新醫(yī)學(xué)動(dòng)物研究中心提供。

1.4 方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液(0.1mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6只25mL容量瓶中，加體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液至5mL，然后分別加入0.1mol/mL三氯化鋁-甲醇溶液10mL，用體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，放置10min，在272nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得回歸方程為：Y＝29.302x＋0.0213，R2＝0.9999，在0.1～0.5mg/mL之間有良好的線性關(guān)系。

1.4.2 單因素試驗(yàn)

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、溫度、提取時(shí)間、料液比4個(gè)因素對(duì)玉米須黃酮提取率的影響，用熱回流法進(jìn)行提取，按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法計(jì)算黃酮含量，選擇最佳單因素提取條件。每次準(zhǔn)確稱取玉米須2.0g，分別以乙醇體積分?jǐn)?shù)(40%、50%、60%、70%、80%)、提取溫度(50、60、70、80、90℃)、提取時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)和料液比(g/mL)(1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)為影響因素進(jìn)行試驗(yàn)。單因素試驗(yàn)的固定工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、提取溫度80℃、提取2.0h、料液比1:30。

1.4.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定響應(yīng)面設(shè)計(jì)中每個(gè)因素的適宜范圍。以乙醇體積分?jǐn)?shù)(X1)、提取溫度(X2)、提取時(shí)間(X3)、料液比(X4)為考察對(duì)象，以黃酮提取率為參考值(Y)，采用SAS 9.1軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 玉米須黃酮提取工藝優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

1.4.4 玉米須黃酮粗提物抗氧化實(shí)驗(yàn)

按照最佳工藝條件提取所得到的玉米須黃酮粗提物，經(jīng)真空干燥后，以水為溶劑分別配成1 0、2 0、40mg/mL溶液。將ICR小鼠隨機(jī)分為空白組、陽(yáng)性藥組以及玉米須黃酮粗提物低、中、高劑量組，每組10只。空白組給予水，陽(yáng)性藥組按照400mg/kg給予VC，低、中、高劑量組分別按照200、400、800mg/kg給予玉米須黃酮粗提物，連續(xù)灌胃給藥30d。末次給藥前禁食不禁水12h，末次給藥1h后，摘眼球取血，分離血清，取肝臟，以試劑盒方法測(cè)定血清及肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)的含量，采用SPSS軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

圖1 各單因素對(duì)提取率的影響Fig.1 One-factor-at-a-time analysis of the effects of ethanol concentration, extraction temperature, extraction time, material-to-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，黃酮的提取率最大，此后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大提取率減少，可能由于60%乙醇溶液的極性與黃酮類化合物極性相似，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，一些脂溶性物質(zhì)的溶出增加，影響了黃酮類物質(zhì)的浸出；提取溫度為80℃時(shí)，提取率最大，超過(guò)80℃，提取率下降,可能由于溫度升高，提取溶劑揮發(fā)，導(dǎo)致提取率下降；提取時(shí)間為2.0h時(shí)，提取率最大，超過(guò)2.0h，提取率下降，可能是由于原因是時(shí)間過(guò)短，黃酮類物質(zhì)還未充分溶出，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，一些熱敏性組分被破壞或溶劑揮發(fā)導(dǎo)致乙醇濃度降低而使黃酮類化合物提取率降低；料液比為1:30(g/mL)時(shí)，提取率最大，此后提取率降低。

2.2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果及方差分析

表2 玉米須黃酮提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

試驗(yàn)號(hào) X1 X2 X3 X4 Y提取率/%1 －1 －1 0 0 0.2698 2 －1 1 0 0 0.3591 3 1 －1 0 0 0.2365 4 1 1 0 0 0.3413 5 0 －1 －1 0.2550 6 0 0 －1 1 0.2586 0 7 1 －1 0.2846 8 0 0 1 1 0.3556 0 0 9 －1 0 0 －1 0.2846 10 －1 0 0 1 0.3301 11 1 0 0 －1 0.2537 12 1 0 0 1 0.3080 13 0 －1 －1 0 0.2383 14 0 －1 1 0 0.2396 15 0 1 －1 0 0.3138 16 0 1 1 0 0.3955 17 －1 0 －1 0 0.2791 18 －1 0 1 0 0.3507 19 1 0 －1 0 0.2329 20 1 0 1 0 0.2725 21 0 －1 0 －1 0.2262 22 0 －1 0 1 0.2419 23 0 1 0 －1 0.3686 24 0 1 0 1 0.3899 25 0 0 0 0 0.3528 26 0 0 0 0 0.3624 27 0 0 0 0 0.3525

通過(guò)SAS 9.1軟件對(duì)表2試驗(yàn)結(jié)果分析獲得多元二次回歸方程：

表3 玉米須黃酮提取工藝優(yōu)化數(shù)學(xué)模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖2 各兩因素交互作用對(duì)玉米須黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of four process parameters on extraction rate of flavonoids

由圖2c可知，黃酮提取率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)和溫度提高呈先上升后下降的趨勢(shì)，且二者有明顯的交互作用。可能由于延長(zhǎng)提取時(shí)間有助于黃酮的充分?jǐn)U散析出，同時(shí)溫度的升高使得分子擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)速度加快，黃酮的析出速率和提取率提高。由圖2f可知，提取時(shí)間較長(zhǎng)、乙醇體積分?jǐn)?shù)較高條件下黃酮提取率較高，二者有明顯的交互作用。可能由于乙醇體積分?jǐn)?shù)較低時(shí)黃酮溶解度較差，提取時(shí)間的延長(zhǎng)使大量水溶性雜質(zhì)如多糖溶出，提取液變得黏稠對(duì)黃酮產(chǎn)生吸附作用，不利于黃酮的快速擴(kuò)散溶出。

2.3 反應(yīng)條件的優(yōu)化與模型驗(yàn)證

由SAS 9.1軟件嶺脊分析得到Y(jié)值最大時(shí)，X1、X2、X3、X4對(duì)應(yīng)的編碼值分別為X1＝－0.17569、X2＝0.84631、X3＝0.42665，X4＝0.26619。對(duì)應(yīng)的最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58.2431%、提取溫度78.4631℃、提取時(shí)間1.7133h、料液比1:26.3306(g/mL)，黃酮提取率理論值為0.4104%。

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、提取溫度78℃、提取時(shí)間1.7h、料液比1:26(g/mL)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，3次平行試驗(yàn)得到實(shí)際平均提取率為0.41%，較理論值高0.005%。因此，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的玉米須黃酮提取條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠，對(duì)實(shí)際應(yīng)用有一定的價(jià)值。

2.4 抗氧化實(shí)驗(yàn)

表4 玉米須黃酮粗提物對(duì)小鼠MDA含量和SOD活力的影響(n=10)Table 4 Effect of corn silk flavonoids on MDA content and SOD activity in mice (n=10)

由表4可知，與空白組比較，低劑量組血清MDA含量明顯降低，P＜0.05；中、高劑量組血清和肝臟組織中MDA含量明顯降低，P＜0.05；高劑量組血清和肝臟組織SOD活力明顯升高。MDA作為脂質(zhì)過(guò)氧化的最終產(chǎn)物是衡量機(jī)體自由基代謝的敏感指標(biāo)，其含量能客觀地反映機(jī)體產(chǎn)生自由基的水平[18-20]。從結(jié)果可知，玉米須黃酮有較好的清除自由的能力，并能增加清除自由基的酶SOD的活力。

3 結(jié) 論

利用軟件SAS 9.1軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，采用響應(yīng)曲面法建立玉米須黃酮提取工藝條件的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型，分析了各因素對(duì)響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，模型擬合程度高，試驗(yàn)誤差小，最佳的提取工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)58%、提取溫度78℃、提取時(shí)間1.7h、料液比1:26(g/mL)，此工藝條件的黃酮提取率為0.41%。研究表明，從玉米須分離及鑒定的化合物主要有黃酮及其苷類、甾醇、生物堿、糖類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、皂苷、微量元素及多種維生素等。本實(shí)驗(yàn)采用乙醇為提取溶劑，主要提取對(duì)象為黃酮苷類。體內(nèi)抗氧化試驗(yàn)表明，玉米須黃酮粗提物有一定的抗氧化能力，能夠降低血清和肝臟中的MDA含量，增加SOD活力，因此，抗氧化實(shí)驗(yàn)可為開(kāi)發(fā)玉米須黃酮作為潛在天然抗氧化劑應(yīng)用于食品和醫(yī)藥工業(yè)中提供理論依據(jù)。

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Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Corn Silk by Response Surface Methodology

ZHANG Yan1，LI Hai-tao2，ZHOU Hong-li1,*
(1. School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China；2. Department of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine Hospital, Changchun 130021, China)

This work reports the use of response surface methodology optimize the extraction of flavonoids from corn silk.The extraction yield of flavonoids was investigated with respect to four variables including ethanol concentration, temperature,time and material-to-liquid ratio. A multivariable quadratic regression equation was built using a four-variable, three-level Box-Behnken experimental design. The optimal conditions for extracting flavonoids from corn silk were determined as 1.7 h extraction with 58% ethanol at a material-to-liquid ratio of 1:26 (g/mL) and 78 ℃. Under these conditions, the extraction efficiency of flavonoids was 0.41%. Oral ingestion of the flavonoids extracted from corn silk resulted in reduced MDA content in the serum and liver of mice and enhanced SOD activity, suggesting that these compounds have antioxidant effects in mice.

flavonoids from corn silk；response surface methodology；antioxidation

R285.5

A

1002-6630(2012)18-0133-05

2011-08-15

吉林省教育廳科技項(xiàng)目(2010第175號(hào))

張艷(1981—)，女，講師，博士，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)。E-mail：zyzxorange@126.com

*通信作者：周鴻立(1967—)，女，教授，博士，研究方向?yàn)橹兴幓瘜W(xué)。E-mail：zhl67@126.com