響應面法優化玉米須黃酮提取工藝

張 艷，李海濤，周鴻立,*

(1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.長春中醫藥大學附屬醫院藥劑科，吉林 長春 130021)

響應面法優化玉米須黃酮提取工藝

張 艷1，李海濤2，周鴻立1,*

(1.吉林化工學院化學與制藥工程學院，吉林 吉林 132022；2.長春中醫藥大學附屬醫院藥劑科，吉林 長春 130021)

采用響應面法優化玉米須黃酮的提取工藝條件。以乙醇體積分數、提取溫度、提取時間和料液比為考察因素，黃酮提取率為響應值，進行四因素三水平Box-Behnken試驗設計，獲得多元二次回歸方程；考察玉米須黃酮體內抗氧化作用。結果表明：最佳提取工藝條件為乙醇體積分數58%、提取溫度78℃、提取時間1.7h、料液比1:26(g/mL)，此工藝條件黃酮得率為0.41%。玉米須黃酮能夠降低血清和肝臟中的丙二醛含量，增加超氧化物歧化酶活力，具有一定的抗氧化能力。

玉米須黃酮；響應面；抗氧化

玉米(Zea maysL.)為禾本科玉蜀屬植物，是我國廣泛種植的傳統農作物。玉米須為玉米的花柱和柱頭，是我國傳統藥食同源的中草藥，為《中華人民共和國衛生部藥材標準》收錄的常用藥材品種之一。玉米須具有利水消腫、降壓降糖等功效，用于治療水腫、黃疸、高血壓、糖尿病等病癥；含有多種活性成分[1-3]，如黃酮類、多糖類、揮發油、皂苷等。

響應面分析法[4-8]是利用合理的試驗設計，通過試驗得到的相關數據，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法。隨著計算機的發展，它已廣泛地應用于農業、生物、食品、化學、制造等領域。目前關于玉米須黃酮提取工藝的報道[9-13]，多采用正交試驗設計的方法，而采用響應面法優化玉米須黃酮提取工藝尚未見報道。本研究以玉米須為試驗材料，利用Box-Behnken試驗設計原理，采用四因素三水平的響應面分析法，優化玉米須黃酮提取的最佳工藝條件，并研究其體內抗氧化作用，為進一步開發和利用玉米須資源提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米須2010年10月采收于吉林省吉林市郊區，經吉林大學王廣樹教授鑒定為玉蜀黍玉米(Zea maysL.)的干燥花柱和柱頭，實驗前洗凈、曬干、剪碎、干燥通風處保存。

無水乙醇、三氯化鋁、甲醇均為國產分析純；丙二醛、超氧化物化酶、考馬斯亮藍試劑盒 南京建成試劑有限公司；蘆丁對照品 中國(長春)藥品生物制品檢定所。

1.2 儀器與設備

RE-52A旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠；HH-S恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市正基儀器有限公司；725型紫外光柵分光光度計 山東高密彩虹分析儀器有限公司；LDZ-5-2低速自動平衡離心機 北京醫用離心機廠；FA-2004分析天平 上海精細科技儀器廠。

1.3 試驗動物

ICR小鼠，18～22g，合格證號：醫動字第scxk-(吉)-2010-0011，由長春高新醫學動物研究中心提供。

1.4 方法

1.4.1 標準曲線的制備

精密吸取蘆丁對照品溶液(0.1mg/mL)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6只25mL容量瓶中，加體積分數60%乙醇溶液至5mL，然后分別加入0.1mol/mL三氯化鋁-甲醇溶液10mL，用體積分數60%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，放置10min，在272nm波長處測定吸光度。以吸光度為橫坐標、對照品質量濃度為縱坐標，繪制標準曲線，求得回歸方程為：Y＝29.302x＋0.0213，R2＝0.9999，在0.1～0.5mg/mL之間有良好的線性關系。

1.4.2 單因素試驗

考察乙醇體積分數、溫度、提取時間、料液比4個因素對玉米須黃酮提取率的影響，用熱回流法進行提取，按標準曲線方法計算黃酮含量，選擇最佳單因素提取條件。每次準確稱取玉米須2.0g，分別以乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)、提取溫度(50、60、70、80、90℃)、提取時間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0h)和料液比(g/mL)(1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)為影響因素進行試驗。單因素試驗的固定工藝條件為乙醇體積分數60%、提取溫度80℃、提取2.0h、料液比1:30。

1.4.3 響應面試驗設計

根據Box-Behnken試驗設計原理，在單因素試驗基礎上，確定響應面設計中每個因素的適宜范圍。以乙醇體積分數(X1)、提取溫度(X2)、提取時間(X3)、料液比(X4)為考察對象，以黃酮提取率為參考值(Y)，采用SAS 9.1軟件進行響應面試驗設計，試驗因素水平見表1。

表1 玉米須黃酮提取工藝優化Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and their coded levels tested in response surface analysis

1.4.4 玉米須黃酮粗提物抗氧化實驗

按照最佳工藝條件提取所得到的玉米須黃酮粗提物，經真空干燥后，以水為溶劑分別配成1 0、2 0、40mg/mL溶液。將ICR小鼠隨機分為空白組、陽性藥組以及玉米須黃酮粗提物低、中、高劑量組，每組10只?？瞻捉M給予水，陽性藥組按照400mg/kg給予VC，低、中、高劑量組分別按照200、400、800mg/kg給予玉米須黃酮粗提物，連續灌胃給藥30d。末次給藥前禁食不禁水12h，末次給藥1h后，摘眼球取血，分離血清，取肝臟，以試劑盒方法測定血清及肝組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力和丙二醛(MDA)的含量，采用SPSS軟件對數據進行t檢驗。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

圖1 各單因素對提取率的影響Fig.1 One-factor-at-a-time analysis of the effects of ethanol concentration, extraction temperature, extraction time, material-to-liquid ratio on extraction rate of flavonoids

由圖1可知，乙醇體積分數為60%時，黃酮的提取率最大，此后隨乙醇體積分數的增大提取率減少，可能由于60%乙醇溶液的極性與黃酮類化合物極性相似，隨著乙醇體積分數的升高，一些脂溶性物質的溶出增加，影響了黃酮類物質的浸出；提取溫度為80℃時，提取率最大，超過80℃，提取率下降,可能由于溫度升高，提取溶劑揮發，導致提取率下降；提取時間為2.0h時，提取率最大，超過2.0h，提取率下降，可能是由于原因是時間過短，黃酮類物質還未充分溶出，時間過長，一些熱敏性組分被破壞或溶劑揮發導致乙醇濃度降低而使黃酮類化合物提取率降低；料液比為1:30(g/mL)時，提取率最大，此后提取率降低。

2.2 響應面法試驗設計結果及方差分析

表2 玉米須黃酮提取工藝優化響應面試驗設計及結果

Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

試驗號 X1 X2 X3 X4 Y提取率/%1 －1 －1 0 0 0.2698 2 －1 1 0 0 0.3591 3 1 －1 0 0 0.2365 4 1 1 0 0 0.3413 5 0 －1 －1 0.2550 6 0 0 －1 1 0.2586 0 7 1 －1 0.2846 8 0 0 1 1 0.3556 0 0 9 －1 0 0 －1 0.2846 10 －1 0 0 1 0.3301 11 1 0 0 －1 0.2537 12 1 0 0 1 0.3080 13 0 －1 －1 0 0.2383 14 0 －1 1 0 0.2396 15 0 1 －1 0 0.3138 16 0 1 1 0 0.3955 17 －1 0 －1 0 0.2791 18 －1 0 1 0 0.3507 19 1 0 －1 0 0.2329 20 1 0 1 0 0.2725 21 0 －1 0 －1 0.2262 22 0 －1 0 1 0.2419 23 0 1 0 －1 0.3686 24 0 1 0 1 0.3899 25 0 0 0 0 0.3528 26 0 0 0 0 0.3624 27 0 0 0 0 0.3525

通過SAS 9.1軟件對表2試驗結果分析獲得多元二次回歸方程：

表3 玉米須黃酮提取工藝優化數學模型方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

圖2 各兩因素交互作用對玉米須黃酮提取率影響的響應面及等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots showing the effects of four process parameters on extraction rate of flavonoids

由圖2c可知，黃酮提取率隨提取時間的延長和溫度提高呈先上升后下降的趨勢，且二者有明顯的交互作用。可能由于延長提取時間有助于黃酮的充分擴散析出，同時溫度的升高使得分子擴散運動速度加快，黃酮的析出速率和提取率提高。由圖2f可知，提取時間較長、乙醇體積分數較高條件下黃酮提取率較高，二者有明顯的交互作用?？赡苡捎谝掖俭w積分數較低時黃酮溶解度較差，提取時間的延長使大量水溶性雜質如多糖溶出，提取液變得黏稠對黃酮產生吸附作用，不利于黃酮的快速擴散溶出。

2.3 反應條件的優化與模型驗證

由SAS 9.1軟件嶺脊分析得到Y值最大時，X1、X2、X3、X4對應的編碼值分別為X1＝－0.17569、X2＝0.84631、X3＝0.42665，X4＝0.26619。對應的最佳工藝條件為乙醇體積分數58.2431%、提取溫度78.4631℃、提取時間1.7133h、料液比1:26.3306(g/mL)，黃酮提取率理論值為0.4104%。

選取乙醇體積分數58%、提取溫度78℃、提取時間1.7h、料液比1:26(g/mL)進行驗證實驗，3次平行試驗得到實際平均提取率為0.41%，較理論值高0.005%。因此，采用響應面設計優化得到的玉米須黃酮提取條件參數準確可靠，對實際應用有一定的價值。

2.4 抗氧化實驗

表4 玉米須黃酮粗提物對小鼠MDA含量和SOD活力的影響(n=10)Table 4 Effect of corn silk flavonoids on MDA content and SOD activity in mice (n=10)

由表4可知，與空白組比較，低劑量組血清MDA含量明顯降低，P＜0.05；中、高劑量組血清和肝臟組織中MDA含量明顯降低，P＜0.05；高劑量組血清和肝臟組織SOD活力明顯升高。MDA作為脂質過氧化的最終產物是衡量機體自由基代謝的敏感指標，其含量能客觀地反映機體產生自由基的水平[18-20]。從結果可知，玉米須黃酮有較好的清除自由的能力，并能增加清除自由基的酶SOD的活力。

3 結 論

利用軟件SAS 9.1軟件進行試驗設計，采用響應曲面法建立玉米須黃酮提取工藝條件的二次多項式數學模型，分析了各因素對響應值的影響。結果表明，模型擬合程度高，試驗誤差小，最佳的提取工藝條件為乙醇體積分數58%、提取溫度78℃、提取時間1.7h、料液比1:26(g/mL)，此工藝條件的黃酮提取率為0.41%。研究表明，從玉米須分離及鑒定的化合物主要有黃酮及其苷類、甾醇、生物堿、糖類、有機酸、揮發油、皂苷、微量元素及多種維生素等。本實驗采用乙醇為提取溶劑，主要提取對象為黃酮苷類。體內抗氧化試驗表明，玉米須黃酮粗提物有一定的抗氧化能力，能夠降低血清和肝臟中的MDA含量，增加SOD活力，因此，抗氧化實驗可為開發玉米須黃酮作為潛在天然抗氧化劑應用于食品和醫藥工業中提供理論依據。

[1]徐燕, 梁敬鈺. 玉米須的化學成分研究[J]. 中草藥, 2006, 37(6): 831-833.

[2]任順成, 丁霄霖. 玉米須黃酮類成分的提取分離與結構鑒定(Ⅰ)[J]. 中草藥, 2004, 35(8): 857-858.

[3]徐燕, 鄒中梅, 梁敬鈺. 玉米須的化學成分[J]. 中國天然藥物, 2008,6(3): 237-238.

[4]沈其君. SAS統計分析[M]. 南京: 東南大學出版社, 2009: 9-56.

[5]慕運動. 響應面方法及其在食品工業中的應用[J]. 鄭州工程學院學報, 2001, 22(3): 91-94.

[6]AHUJA S K, FERREIRA G M, MOREIRA A R. Application of Plaekett-Burman design and response surface methodology to achieve exponential growth for aggregated shipworm bacterium[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2004, 85(6): 666-675.

[7]SILVA E M, ROGEZ H, LARONDELLE Y. Optimization of extraction of phenolics fromInga edulisleaves using response surface methodology[J]. Separation and Purification Technology, 2007, 55(3): 381-387.

[8]WANG Jing, SUN Baoguo, CAO Yanping, et al. Optimisation of ultrasound-assisted extraction of phenolic compounds from wheat bran[J].Food Chemistry, 2008, 106(2): 804-810.

[9]胡改鑫, 楊堯, 楊思思, 等. 超聲波提取玉米須總黃酮的工藝研究[J].糧油加工, 2009, 12(3): 120-122.

[10]ZHOU hongli, DONG Weiquan, XIAO Zhenjing, et al. Microwaveassisted extraction of total flavonoids from corn silk[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2011, 22(2): 483-485.

[11]王寧, 徐艷, 韓笑非. 酶法提取玉米須總黃酮工藝研究試驗[J]. 遼寧中醫雜志, 2009, 36(6): 994-996.

[12]任順成, 丁霄霖. 玉米須中總黃酮的提取及樹脂精制[J]. 中草藥,2003, 34(12): 1092-1094.

[13]JOSEPH N N. Inhibition ofAspergillus flavusgrowth by silk extracts of resistant and susceptible corn[J]. J Agr Food Chem, 1996, 44(8): 1982-1983.

[14]紀麗蓮, 范怡梅. 玉米須提取物對食品腐敗菌及致病菌抑制作用的研究[J]. 食品科學, 2000, 21(12): 131-134.

[15]LIU Wei, YU Yanying, YANG Ruzhen, et al. Optimization of total flavonoid compound extraction from gynura medica leaf using response surface methodology and chemical composition analysis[J]. Int J Mol Sci, 2010, 11(11): 4750-4763.

[16]XIAO Weihua, HAN Lujia, SHI Bo. Optimization of microwave-assisted extraction of flavonoid fromRadix Astragaliusing response surface methodology[J]. Sep Sci and Technol, 2008, 43(3): 671-681.

[17]ASHAN S E, MIGANAD T, ARIFF A, et al. Optimization of enzymatic synthesis of palm-based kojic acid ester using response surface methodology[J]. J Oleo Sci, 2009, 58(10): 503-510.

[18]方敏, 占才貴, 宮智勇. 玉米須總黃酮的提取與抗氧化活性研究[J].食品科學, 2009, 30(18): 206-208.

[19]MILLER S S, REID L M, BUTLER G, et al. Long chain alkanes in silk extracts of maize genotypes with varying resistance toFusarium graminearum[J]. J Agri Food Chem, 2003, 51(23): 6702-6708.

[20]熊皓平, 楊偉麗, 張友勝, 等. 天然植物抗氧化劑的研究進展[J]. 天然產物研究與開發, 2001, 15(5): 75-78.

Optimization of Extraction Process for Flavonoids from Corn Silk by Response Surface Methodology

ZHANG Yan1，LI Hai-tao2，ZHOU Hong-li1,*
(1. School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Jilin Institute of Chemical Technology, Jilin 132022, China；2. Department of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine Hospital, Changchun 130021, China)

This work reports the use of response surface methodology optimize the extraction of flavonoids from corn silk.The extraction yield of flavonoids was investigated with respect to four variables including ethanol concentration, temperature,time and material-to-liquid ratio. A multivariable quadratic regression equation was built using a four-variable, three-level Box-Behnken experimental design. The optimal conditions for extracting flavonoids from corn silk were determined as 1.7 h extraction with 58% ethanol at a material-to-liquid ratio of 1:26 (g/mL) and 78 ℃. Under these conditions, the extraction efficiency of flavonoids was 0.41%. Oral ingestion of the flavonoids extracted from corn silk resulted in reduced MDA content in the serum and liver of mice and enhanced SOD activity, suggesting that these compounds have antioxidant effects in mice.

flavonoids from corn silk；response surface methodology；antioxidation

R285.5

A

1002-6630(2012)18-0133-05

2011-08-15

吉林省教育廳科技項目(2010第175號)

張艷(1981—)，女，講師，博士，研究方向為中藥藥理學。E-mail：zyzxorange@126.com

*通信作者：周鴻立(1967—)，女，教授，博士，研究方向為中藥化學。E-mail：zhl67@126.com