超聲波提取花椒皮總黃酮工藝及其抗氧化性研究

高亞妮，田呈瑞*，康宇新，郝 果，周 瑞

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062)

超聲波提取花椒皮總黃酮工藝及其抗氧化性研究

高亞妮，田呈瑞*，康宇新，郝 果，周 瑞

(陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西 西安 710062)

以花椒為原料，采用超聲波輔助法提取花椒果皮中的總黃酮，在單因素試驗基礎上設計正交試驗研究提取最佳工藝條件。結果表明：花椒果皮總黃酮超聲提取的最佳工藝條件為料液比1:30(g/mL)、提取時間50min、乙醇體積分數45%。采用紫外分光光度法測定其總黃酮含量，得率可達到3.56%。花椒皮總黃酮清除DPPH自由基和·OH的IC50分別為0.855μg/mL和132.18μg/mL；同時可以看出花椒皮總黃酮也具有很強的還原能力，且高于BHT。

超聲波提取；花椒果皮；黃酮；正交試驗；抗氧化

花椒(Zanthoxylum bungeanumMaxim，ZBM)為蕓香科花椒屬植物，其果皮是我國特有的藥食兩用香料，具有驅蟲麻醉、防腐、保健、增加食欲等作用[1]。我國花椒主產于四川漢源、陜西韓城、鳳縣、河南輝縣、河北陟縣等地。花椒果皮中的主要成分有花椒揮發油、生物堿、酰胺類、香豆素、黃酮類等，此外還有少量的氨基酸和礦物質[2-3]。花椒的深加工產品主要有花椒精油、花椒油樹脂、微膠囊等[4]。目前，對花椒的研究中主要集中在花椒油的提取，酰胺類等研究，然而，對花椒中的多酚、香豆素、黃酮等活性物質的相關研究，目前尚未見報道。黃酮類物質具有抗氧化抗衰老、抗炎鎮痛、抗癌防癌等方面有顯著性的作用[5-6]。超聲波輔助法可以通過空化作用快速地提取植物細胞內的有效成分，具有省時、高效、操作簡單等作用[7]。因此，本實驗研究超聲波技術提取花椒皮總黃酮的影響因素，并通過二次回歸試驗優化提取工藝條件；并研究花椒皮總黃酮的抗氧化性，為花椒的進一步綜合開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

花椒：陜西省韓城市西莊鎮花椒交易市場；選取顆粒飽滿而有光澤的干花椒果皮，用粉碎機進行粉碎成細分，5 0℃烘干過6 0目篩，入袋保存，備用。

乙醚(沸點30～60℃；分析純)、無水乙醇(分析純)天津市天力化學試劑有限公司；亞硝酸鈉(分析純)、硝酸鋁(分析純) 西安化學試劑有限公司；氫氧化鈉(分析純) 上海山海工學團實驗二廠；蘆丁(色譜級) 西安東瑞科教實驗儀器有限公司；DPPH(分析純) 美國Sigma公司；BHT(食品級) 天津市福晨化學試劑有限公司；其他試劑為分析純。

722型分光光度計 上海光譜儀器有限公司；RE-52AA型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；KQ-200KDE型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 超聲波提取花椒皮總黃酮工藝流程

花椒干果皮粉→索氏抽提(脫脂及除脂溶性色素)→烘干→超聲波提取→冷卻→定容→測定

1.2.2 提取溶劑的選擇

采用超聲波輔助提取法對花椒中的總黃酮進行提取時，可以選擇不同的有機溶劑作為溶劑，但是考慮到成本的高低，毒性的大小和回收的難易性，本實驗中選用無水乙醇作為花椒黃酮的提取溶劑。

1.2.3 蘆丁標準曲線的繪制

準確稱取蘆丁標品40mg，用30%乙醇溶液溶解并定容至100mL，即為蘆丁的標準溶液(0.4mg/mL)。分別取上述蘆丁標品0、0.5、1、1.5、2mL于10mL容量瓶中，用80%乙醇溶液補至5mL，加入0.3mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6min，接著加入0.3mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6min后再加入4mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度線，15min后在波長510nm處測定吸光度[8-9]。以蘆丁標品質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。線性方程為y＝11.74x－0.0058，R2＝0.9991。

1.2.4 樣品中總黃酮的測定

移取0.5mL提取液于10mL容量瓶中，用80%乙醇溶液補至5mL，加入0.3mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6min，接著加入0.3mL 10%硝酸鋁溶液，靜置6min后再加入4mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度線，15min后在波長510nm處測定吸光度。計算總黃酮得率：

式中：y為樣品中總黃酮得率/%；c為依據標準曲線計算出的待測液中黃酮的質量濃度/(mg/mL)；m為樣品的質量/g；V1為樣品提取液測定時用的體積/ 0.5mL；V2為樣品提取液的總體積/50mL；V3為測定樣品時定容的體積/10mL。

1.2.5 花椒總黃提取參數的確定

單因素試驗條件：料液比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35)；提取時間(20、30、40、50、60、70min)；提取溫度(30、40、50、60、70、80℃)；超聲功率(80、100、120、140、160、180W)；乙醇體積分數(40%、50%、60%、70%、80%)。

在單因素試驗基礎上進行正交試驗，得出最佳提取工藝條件。

1.2.6 DPPH自由基清除率的測定

稱取10mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，配制成濃度1×10-4mol/L的溶液備用。將花椒皮總黃酮提取液稀釋成不同濃度梯度，各取2mL不同濃度的稀釋液于試管中，再加入2mL配制好的DPPH溶液，混合均勻，反應30min后，于波長517nm處測定其吸光度(Ai)；以2mL無水乙醇代替2mL DPPH的吸光度(Aj)；以2mL無水乙醇代替2mL待測溶液的吸光度(A0)[10-11]。計算DPPH自由基清除率(Y)：

1.2.7 對·OH清除率的測定

將花椒皮總黃酮提取液用蒸餾水配制成不同濃度，各取1mL不同濃度的稀釋液于試管中，依次地加入1mL 6mmol/L FeSO4和1mL 6mmol/L H2O2，混合均勻后靜置10min；再加入1mL 6mmol/L水楊酸，混勻靜置30min，在波長510nm處測定其吸光度(Ai)；以蒸餾水代替水楊酸的吸光度(Aj)；以蒸餾水代替總黃酮溶液的吸光度(A0)[12-13]。計算·OH清除率(Y)：

1.2.8 花椒皮總黃酮還原力的測定[14-15]

取2.5mL不同濃度總黃酮溶液，加入2.5mL 0.2mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)和2.5mL 1%鐵氰化鉀溶液，50℃水浴20min后急速冷卻，加入含2.5mL 10%三氯乙酸溶液，再取5mL混合液，加入4mL蒸餾水及1mL 0.1%三氯化鐵水溶液，混合10min于波長700nm處測定吸光度。吸光度越大則還原力越強。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取時間對花椒皮總黃酮得率的影響

稱取6份脫脂花椒粉(每份1g)于錐形瓶中，按照料液比1:25在每份中加入50%乙醇溶液25mL，設置提取溫度45℃，提取功率100W，采用超聲波震蕩分別提取20、30、40、50、60、70min，過濾并定容至50mL，在510nm處測定提取液的吸光度。考察提取時間對花椒皮總黃酮得率的影響。

圖1 提取時間對總黃酮得率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，總黃酮得率隨著提取時間的延長呈上升的趨勢，50min達到最大，之后得率有所下降。原因可能是由Fick定理可知，提取時間與得率呈正比，在一定條件下，得率隨超聲提取時間的延長而增大[16]。但是長時間地進行超聲波提取，改變了超聲作用的環境，造成黃酮類物質的氧化，致使總黃酮得率反而有所下降[17-18]。綜合考慮選擇50min為最佳提取時間。

2.1.2 提取溫度對花椒皮總黃酮得率的影響

設置提取溫度20、30、40、50、60、70℃，其他操作條件同2.1.1節，考察提取溫度對花椒皮總黃酮得率的影響。

圖2 提取溫度對總黃酮得率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，在40℃時，花椒皮總黃酮得率達到了最大值，其之前和之后的得率都有所下降，并且得率都基本一致，差異不明顯。可能是在超聲波過程中，溫度受到外部因素的影響，不易控制，導致40℃前后得率差異不大。

2.1.3 提取功率對超聲波提取效果的影響

設置超聲波功率80、100、120、140、160、180W，其他操作條件同2.1.1節，考察提取功率對花椒皮總黃酮得率的影響。

由圖3可知，花椒皮總黃酮得率隨著提取功率的增大，140W時得率達到最大值，但之后得率明顯下降，并且在高功率提取時對儀器的損耗較大，因此選擇140W為最佳提取功率。

圖3 超聲功率對總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment power on extraction rate of total flavonoids

2.1.4 乙醇體積分數對超聲波提取效果的影響

設置乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%、90%，其他操作條件同2.1.1節，考察乙醇體積分數對花椒皮總黃酮得率的影響。

圖4 乙醇體積分數對總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由圖4可知，在50%和60%乙醇體積分數下，花椒皮總黃酮得率比較高，之后得率明顯下降，在90%時又有所上升，但低于50%時的得率。其原因可能是花椒中含有的脂溶性黃酮較少，而醇溶性雜質的含量隨著乙醇體積分數的增加而增加，減少了黃酮與溶劑結合的機會，從而導致得率的下降[19]。綜合考慮黃酮的得率和乙醇的成本，選擇50%的乙醇最佳。

2.1.5 料液比對超聲波提取效果的影響

設置料液比1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 (g/mL)，其他操作條件同2.1.1節，考察料液比對花椒皮總黃酮得率的影響。

由圖5可知，隨著提取劑用量的增大，花椒皮總黃酮得率逐漸增加，在1:25時得率達到最大值，其后再增加溶劑的量，得率反而有所下降。其原因可能是開始時隨著溶劑的增加，加大了有效成分從細胞壁內擴散出來，但溶劑用量增大到一定程度，減少了細胞壁對于超聲波能量的吸收。綜合考慮對乙醇的節省，選1:25為最佳提取料液比。

圖5 料液比對總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of solid-to-solvent on extraction rate of total flavonoids

2.2 超聲波提取花椒皮總黃酮工藝二次旋轉回歸正交試驗優化

2.2.1 試驗因素與水平選取

由單因素試驗結果可知，提取功率各水平對總黃酮得率的影響不大，利用超聲波提取時溫度不是很穩定，所以固定提取溫度和提取功率，選用料液比、提取時間、乙醇體積分數3個因素，進行三因素二次回歸旋轉組合試驗，因素及編碼水平見表1。

表1 超聲波提取花椒皮總黃酮工藝優化二次旋轉回歸正交試驗因素和編碼水平表Table 1 Factors and their coded levels for quadratic regression orthogonal rotary combination design

2.2.2 二次旋轉回歸組合設計及結果

2.2.2.1 回歸方程的建立與檢驗

根據表2結果，建立花椒皮總黃酮得率與料液比、提取時間、乙醇體積分數3因素的數學回歸模型：Y＝3.28949＋0.30883X1－0.01990X2＋0.05705X3－－－－0.03750X1X2－0.17000X1X3－0.06500X2X3。由表3方差分析可知，回歸方程的失擬性檢驗F1＞F0.05(5,8)，差異顯著；回歸性檢驗F2＞F0.01(9,13)，差異極顯著，說明建立的二次旋轉回歸模型適當。在α＝0.10顯著水平剔除不顯著項后，簡化后的回歸方程為：Y＝3.28949＋0.30883X1－－－0.17000X1X3。

各因素對花椒皮總黃酮得率影響程度的大小為料液比＞乙醇體積分數＞提取時間。

表2 超聲波提取花椒皮總黃酮工藝優化二次旋轉回歸正交試驗設計及結果Table 2 Quadratic regression orthogonal rotary combination design protocol and corresponding results

表3 試驗結果方差分析表Table 3 Analysis of variance for the experimental results of quadratic regression orthogonal rotary combination design

2.2.2.2 單因素效應分析

由圖6可知，在所選因素水平內，提取時間和乙醇體積分數對花椒皮總黃酮得率的影響趨勢為先增大后減少；總黃酮得率隨著料液比的增大一直處于上升的趨勢，到達一定程度時，得率趨于穩定。但是隨著料液比的增大，對于乙醇的用量很大，因此提取時應控制其料液比在一定的范圍內。

圖6 單因素效應分析圖Fig.6 Single-factor analysis of the effects of three extraction conditions on extraction rate of total flavonoids

2.2.2.3 雙因素交互作用分析

由方差分析可知，本實驗所建立的回歸模型中，在α＝0.10水平下，X1X2、X2X3交互作用均不顯著，X1X3因素交互作用較顯著，即料液比和乙醇體積分數交互作用對花椒皮總黃酮得率有顯著影響，因此，確定提取時間為零水平，得到料液比和乙醇體積分數交互作用的響應曲面圖。

圖7 料液比和乙醇體積分數對花椒皮總黃酮得率的交互作用Fig.7 Response surface plot showing the interaction effect of solid-tosolvent ratio and ethanol concentration on extraction rate of total flavonoids

由圖7可知，花椒黃酮得率隨料液比和乙醇體積分數的變化而變化。隨著二因素編碼水平的升高，花椒皮總黃酮得率呈明顯的增加趨勢，當二因素編碼值達到一定交互組合后，總黃酮得率緩慢下降。可能的原因是雖然較大的料液比有利于溶質的分散，但高濃度的乙醇不一定就利于花椒粉中黃酮類物質的溶出。因此，只有當料液比和乙醇體積分數合理搭配時才能獲得很好的提取效果。

2.2.3 提取工藝參數的優化和驗證實驗

通過DPS軟件分析，采用頻率分析方法尋找最優提取條件，總黃酮得率高于3.03%的方案有30個，頻率分析結果見表4。由表4可知，在95%置信區間內花椒皮總黃酮得率高于3.03%的優化提取方案為料液比1:29.795～1:32.175(g/mL)，提取時間46.71～53.29min，乙醇體積分數41.02%～48.11%，取優化后提取條件的平均值方案X1＝1:1.198，X2＝0，X3＝－0.548，即料液比1:30.985(g/mL)、提取時間50min、乙醇體積分數45.48%。為了方便用于指導實際生產，將最佳提取條件定為料液比1:30、提取時間50min、乙醇體積分數45%。按照最佳提取條件進行驗證實驗，重復3次，取平均值，得到花椒皮總黃酮得率為3.56%，與理論值(3.98%)比較接近，進一步說明所用的數學回歸模型是較合適的。

表4 大于3.03%的30個方案中各變量取值的頻率分布Table 4 Frequency distribution of three variables from 30 programs resulting in > 3.03% extraction rate of total flavonoids

2.3 花椒皮總黃酮抗氧化能力的分析

2.3.1 花椒皮總黃酮對DPPH自由基的清除效果

圖8 不同質量濃度總黃酮對DPPH自由基清除效果Fig.8 Comparison of scavenging effects of total flavonoids and BHT at various concentrations on DPPH free radicals

由圖8可以看出，在0.5～2μg/mL質量濃度范圍內，花椒皮總黃酮質量濃度與DDPH自由基清除率表現了良好的量效關系，清除率隨總黃酮質量濃度的增大表現了逐步上升的趨勢。花椒皮總黃酮清除DPPH自由基的IC50為0.855μg/mL，BHT清除DPPH自由基的IC50為1.32μg/mL，BHT的IC50大約是花椒皮總黃酮IC50的1.5倍，花椒皮總黃酮表現出優于BHT的清除自由基的能力。2.3.2 花椒皮總黃酮對·OH清除效果

圖9 不同質量濃度總黃酮對·OH清除效果Fig.9 Comparison of scavenging effects of total flavonoids and BHT at various concentrations on hydroxyl free radicals

由圖9可知，在40～200μg/mL范圍內，花椒皮總黃酮對·OH的清除作用隨質量濃度的增大而增強，但低于BHT對·OH的清除作用。在40～160μg/mL的質量濃度內，BHT的清除作用明顯高于花椒皮總黃酮，在隨后的質量濃度中，花椒皮總黃酮對·OH的清除能力迅速加強，基本與BHT的清除作用趨于一致。通過數學模擬曲線方程可知：花椒皮總黃酮清除·OH的IC50為132.18μg/mL，BHT清除·OH的IC50為127.95μg/mL，在高質量濃度時，兩者的清除能力差異不大。

2.3.3 花椒皮總黃酮還原力分析

圖10 花椒皮總黃酮的還原力Fig.10 Comparison of reducing power of total flavonoids and BHT at various concentrations

由圖10可看出，花椒皮總黃酮和BHT吸光度都隨質量濃度的增大而逐漸增加，其中花椒皮總黃酮吸光度明顯地比BHT的大，增加趨勢也比較快，說明花椒皮總黃酮還原力顯著高于BHT的還原力。一般抗氧化劑是通過自身的還原作用給出電子而清除自由基，還原力越強，花椒皮總黃酮在某些方面表現出越強的抗氧化性。

3 結 論

3.1 通過單因素和二次旋轉回歸正交設計試驗，得到超聲波法提取花椒皮總黃酮的最佳條件為料液比1:30、提取時間50min、乙醇體積分數45%。確定了影響因素的主次順序為料液比＞乙醇體積分數＞提取時間。

3.2 通過清除自由基多體系的研究，花椒皮總黃酮具有極強的清除自由基的能力。其抑制DPPH自由基和·OH的IC50分別為0.855μg/mL和132.18μg/mL，花椒皮總黃酮對自由基的抑制能力大小為DPPH自由基＞·OH；同時可以看出花椒皮總黃酮也具有很強的還原能力，且高于BHT。說明花椒皮總黃酮具有很好的抗氧化作用。

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Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activity of Total Flavonoids fromZanthoxylum bungeanumMaxim Fruit Peel

GAO Ya-ni，TIAN Cheng-rui*，KANG Yu-xin，HAO Guo，ZHOU Rui
(College of Food Engineering and Nutritional Science, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China)

With the aim of developing an ultrasonic-assisted procedure for the extraction of total flavonoids fromZanthoxylum bungeanumMaxim fruit peel, we performed an orthogonal array design based on one-factor-at-a-time experiments to determine optimal extraction conditions. A 45% ethanol/water solution was found to be the best solvent for total flavonoids and the optimal solid-to-solvent ratio was 1:30 (g/mL). An extraction duration of 50 min was found to be optimum. Under these conditions, the yield of total flavonoids was spectrometrically determined to be 3.56%. The IC50 values of the obtained extract for scavenging DPPH and hydroxyl free radicals were 0.855μg/mL and 132.18μg/mL, respectively. Moreover, the total flavonoids extracted fromZanthoxylum bungeanumMaxim fruit peel possessed stronger reducing power than BHT.

ultrasonic-assisted extraction；Zanthoxylum bungeanumMaxim fruit peel；total flavonoids；orthogonal array design；antioxidant activity

TS264

A

1002-6630(2012)18-0077-06

2011-07-25

高亞妮(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為食品資源開發利用。E-mail：kaixingaoyani@163.com

*通信作者：田呈瑞(1955—)，男，教授，研究方向為食品新資源開發與利用。E-mail：chrtian@snnu.edu.cn