黔江腎豆蛋白質提取工藝優化及其功能性質研究

熊家艷，鄧利玲，范超敏，鄒泊羽，鐘 耕,2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市特色食品研究工程技術中心，重慶 400716)

黔江腎豆蛋白質提取工藝優化及其功能性質研究

熊家艷1，鄧利玲1，范超敏1，鄒泊羽1，鐘 耕1,2,*

(1.西南大學食品科學學院，重慶 400716；2.重慶市特色食品研究工程技術中心，重慶 400716)

以黔江腎豆為原料，采用單因素法研究pH值、溫度、液料比、提取時間等因素對其蛋白質提取率的影響，在此基礎上通過響應面分析法優化得出最佳工藝條件堿提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取時間22min、提取溫度48℃，并對提取所得分離蛋白的持水力、吸油性、起泡性、乳化性等功能性質進行測定分析。

黔江腎豆；蛋白提取；分離蛋白；功能性質

蕓豆，學名菜豆(kidney bean)，為豆科(Leguminosae)，蝶形花亞科(Papilionoideae)，菜豆族(Phaseoleae)，菜豆屬(Ph a s e o lu s)植物，主要栽培種包括多花菜豆(Phaseolus multiflorusWilld)和普通菜豆(Phaseolus vulgarislL.)[1]。本實驗研究材料黔江腎豆屬普通菜豆。

蕓豆是全球性的出口農產品，中國是世界蕓豆生產、出口大國，種植面積僅次于印度和巴西，總產量超過82萬噸，產量高品質優良，平均單產超過世界平均單產兩倍以上[2]。近年出口量在30萬噸到63萬噸左右，為我國最主要出口雜豆類，相較大宗糧食作物，出口的價格具有明顯優勢，在農產品出口中具有明顯的競爭優勢[3]。

作為重慶黔江地區特色經濟作物，腎豆具有主根發達、根瘤有固氮能力，喜溫耐寒、對光照要求不嚴格等生物學特性，對于云貴川渝等地大面積冷涼山區其他作物低產甚至無產的貧瘠山坡地極具栽培種植優勢。黔江腎豆感官性質優良、對其營養價值民眾認同基礎較高，具有較大的潛在開發利用價值。黔江腎豆蛋白質含量較高，經測定達(23.08±0.97)%，水分含量(12.21±0.05)%，氨基酸組成評價分析表明，是優良植物蛋白資源。

本實驗研究pH值、溫度、液料比、提取時間等因素對蛋白質提取率的影響，在此基礎上采用響應面方法優化腎豆蛋白質的提取條件，測定分析分離蛋白持水力、吸油性、起泡性、乳化性等功能性質，為腎豆蛋白的提取、開發和利用提供理論基礎和應用依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黔江腎豆(E108°28′04″～108°56′56″， N29°04′29″～29°52′10″)產于重慶黔江；大豆油 金龍魚公司；酪蛋白(化學純，經自動凱氏定氮測定蛋白含量為(74.09 ±0.33)%) 成都科龍化工試劑廠；Folin-酚試劑乙(分析純) Solabio公司。

Folin-酚試劑甲：A液50mL和B液1mL混合配制，現用現配；FoLin-酚試劑A液：1g碳酸鈉溶于50mL 0.1mol/L氫氧化鈉溶液中；Folin-酚試劑B液：將1%硫酸溶液和20g/L酒石酸鈉溶液等體積混合配成；蛋白標準溶液：準確稱取已測定蛋白質質量濃度(凱氏定氮法)的酪蛋白配制成150μg/mL蛋白標準溶液。其他試劑未經注明，均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9070A鼓風干燥箱 上海齊欣科學儀器有限公司；BM251粉碎機 美的集團公司；JH722可見光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；PHS-3C型pH計 上海盛磁儀器有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；KjelFlex K-360自動凱氏定氮儀 瑞士Buchi公司；金燕FSH-2型可調高速勻漿機 江蘇大地自動化儀器廠&環保儀器廠；4K15離心機 美國Sigma公司；ALPAAI-4LSC真空冷凍干燥機 美國Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 原材料準備

腎豆籽粒手工去除雜質及不完善粒，純水浸泡，手工脫皮，60℃干燥后粉碎，過80目篩，篩上部分重新粉碎，過篩。介于腎豆本身脂肪含量很低，避免脫脂過程加工處理及接觸試劑對蛋白的不利影響，不進行脫脂處理。處理好的豆粉密封置4℃保存備用[4]。

1.3.2 腎豆蛋白等電點確定

參照文獻[5]方法略做改進，平行測定3次。

1.3.3 腎豆蛋白提取工藝

1.3.3.1 提取工藝[6]

稱取約5g豆粉，以所需比例去離子水分散，調節pH值至預定值，水浴加熱到預定溫度，水浴振蕩提取一定時間，5000r/min離心10min，上清液定容后取一定量用Folin-酚法測定其蛋白質含量。計算提取率：

1.3.3.2 提取試驗優化設計

研究堿提pH值、料液比、提取時間、提取溫度等因素對腎豆蛋白提取率的影響，在此單因素試驗結果基礎上采用響應面方法優化提取條件，以堿提pH值、料液比、提取時間、提取溫度為自變量，提取率為響應值通過Design Expert 7.0軟件進行4因素3水平響應面試驗設計和數據回歸分析，確定腎豆蛋白提取的最優工藝參數，取3次平行實驗的平均值。

1.3.4 腎豆蛋白基本成分及功能性質測定

1.3.4.1 腎豆蛋白基本成分[7]

粗蛋白含量：自動凱氏定氮儀凱氏定氮法測定；水分：105℃直接干燥法測定；灰分：高溫灼燒稱量法；粗脂肪：索氏抽提法。

1.3.4.2 腎豆蛋白功能性質

腎豆分離蛋白持水性、吸油性的測定：參照Kaur等[8]方法；起泡性和起泡穩定性：參照郭興鳳等[9]方法；乳化性和乳化穩定性：參照Pearce等[10]方法并做相應改動。

1.3.5 數據處理

使用Design Expert 7.0、SPSS 15.0軟件進行實驗設計和結果統計分析。

2 結果與分析

2.1 建立FoLin-酚標準曲線

通過酪蛋白標準液Folin-酚反應建立吸光度(A)與蛋白質質量濃度標準曲線，回歸方程：

蛋白質質量濃度/(μg/mL)＝827.403A－58.780，R2≥0.999，P＜0.01。

2.2 腎豆蛋白等電點確定

蛋白質分子在等電點易發生聚集而沉降，使溶解度降低，通過測定不同沉降pH值處理的蛋白溶液氮溶指數(nitrogen solubility index，NSI)，可測得蛋白質等電點。見圖1，該蛋白質在pH4.50時的氮溶指數比陡然降低，表明pH4.50時該蛋白質溶解度最小，即為其等電點。分離腎豆蛋白質時應用酸沉pH值。

圖1 不同pH值時氮溶指數Fig.1 Nitrogen solubility index (NSI) obtained for kidney bean protein under various pH conditions

2.3 各因素對蛋白質提取率的影響

2.3.1 堿提pH值對提取率的影響

固定液料比10:1、提取溫度60℃、提取時間90min。由圖2可知，堿提pH值對蛋白提取率影響較大，當pH9.00時達到最大，隨后降低。

圖2 pH值對提取率的影響Fig.2 Effect of pH on the extraction rate of ASP

2.3.2 液料比對提取率的影響

固定堿提pH9.0、提取溫度60℃、提取時間90min。由圖3可知，液料比在10:1以下時，蛋白提取率隨加液量的增加而逐漸升高，當液料比大于10以后，繼續增加提取液比例對蛋白提取率的提高作用不明顯。

圖3 液料比對提取率的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of ASP

2.3.3 提取時間比對提取率的影響

固定堿提pH9.0、液料比10:1、提取溫度60℃。由圖4可知，隨時間增長，提取率增加，20min時達到最高，但時間繼續增長提取率則下降。

圖4 提取時間對提取率的影響Fig.4 Effect of extraction time on the extraction rate of ASP

2.3.4 溫度對提取率的影響

固定堿提pH9.0、液料比10:1、提取時間90min。由圖5可知，提取溫度為50℃時，提取率最高。

圖5 提取溫度對提取率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction rate of ASP

2.4 響應面分析試驗設計[11]與結果分析

表1 黔江腎豆蛋白質提取工藝優化響應面分析試驗因素與水平Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters used in response surface analysis

表2 黔江腎豆蛋白質提取工藝優化響應面分析試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

堿提pH值、料液比、提取時間、提取溫度對提取率影響均極顯著(P＜0.01)，以提取率為響應值，通過Design Expert 7.0設計4因素3水平響應面分析試驗。試驗因素及水平見表1，試驗設計及結果見表2。

通過Design Expert 7.0軟件對響應值與各因素進行回歸擬合，得到回歸方程：

提取率Y＝17.88－0.17A＋0.27B－0.24C－0.23D－0.27AB－0.027AC＋0.037AD－0.013BC＋0.022BD－0.018CD－1.05A2－0.45B2－0.65C2－0.63D2

表3 回歸分析結果Table 3 Analysis of variance for the fitted quadratic regression model

如表3所示，該回歸模型相對于真實值，R2＝0.9579，擬合度高，回歸極顯著。模型失擬值相對于純誤差顯著性評價為不顯著，F＝0.75，P＝0.6786＞0.1，表明所建模型成立。各自變量二次項及自變量B、C、D影響極顯著，自變量堿提pH值、堿提pH值及液料比間交互作用對響應值影響顯著。各因素對提取率影響程度為各變量二次項＞液料比＞提取時間＞提取溫度＞堿提pH值＞堿提pH值及液料比的交互影響作用。

響應面分析結果見圖6，曲面圖直觀反映模型設定反應條件同提取率間對應關系，等高圖能直觀看出各因素交互作用對提取率的影響。橢圓表示二因素交互作用顯著，等高線越趨向于圓表示其交互作用越不顯著[12]。由圖6可見，在本研究取值范圍內，堿提pH與液料比交互作用較顯著。

通過Design Expert 得出最優化提取工藝條件為堿提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取時間21.88min、提取溫度48.20℃，回歸模型預測提取率理論值達(17.98± 0.08)%。考慮到實際實驗條件，確定修正提取工藝條件為堿提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取時間22min、提取溫度48℃。驗證實驗提取率實測值18.02%，實測值與回歸方程預測值吻合良好。

圖6 各兩因素交互作用對蛋白提取率影響的響應面及等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots for the effects of four variables on the extraction rate of ASP

2.5 腎豆分離蛋白基本成分及功能性質測定結果

2.5.1 腎豆分離腎白基本成分

表4 腎豆分離腎白基本成分Table 4 Proximate chemical composition of ASP extracted from kidney beans

由表4可知，腎豆分離蛋白質的蛋白含量(82.41± 0.89)%，參照大豆蛋白粉國家標準，除水分含量稍偏高外，其余均在限值內。腎豆分離蛋白粉呈淡黃色、無異味。

2.5.2 持水性

蛋白質的持水性影響食品體系整體水分含量、水分保持情況，添加在食品體系中通常應用其增稠、保濕等功能性質。體系pH值及溫度對分離蛋白持水性的影響見圖7，pH值和溫度對持水性影響明顯，當pH5時，持水性最低，因為接近蛋白質等電點，蛋白質分子的分散程度較低，水化能力小。隨著pH值遠離等電點，蛋白質所帶凈電荷增多，蛋白質分子的靜電斥力增加、分散程度增高，水化能力和持水性增強，pH9.0時最高，之后隨pH值繼續增高，持水性反而下降，推測是過高pH值導致蛋白質變性所致。在60℃以下時，持水性隨溫度的升高而增大，這可能是由于溫度增加使蛋白質溶解度增大，并且在溫度和水分共同作用下致密的結構構象發生了一定的改變，蛋白質分子的解離伸展有利于蛋白質分子和水分子的相互作用；但隨著溫度的進一步升高，蛋白質變性致使蛋白質持水性下降。

圖7 pH值及溫度對腎豆分離蛋白持水性的影響Fig.7 Effects of pH and temperature on water-holding capacity of ASP extracted from kidney beans

2.5.3 吸油性

腎豆分離蛋白在不同溫度下吸附油脂能力見圖8，從室溫20℃開始，分離蛋白的吸油性隨溫度的升高而升高，可能原因是隨溫度升高，蛋白質分子發生伸展、解離、變性等構象變化，內部非極性鍵曝露且油脂結合能力增大。但在0℃時，表現為較高吸油性，可能是因為低溫使油的流動性降低，更容易被蛋白分子截留。

圖8 溫度對腎豆分離蛋白持油性的影響Fig.8 Effect of temperature on oil-absorbing capacity of isolated protein of ASP extracted from kidney beans

2.5.4 起泡及起泡穩定性

起泡性及起泡穩定性反映蛋白質攪打起泡的能力，蛋白質在氣-液界面形成堅韌的薄膜，使大量氣泡進入和穩定的能力，與蛋白質的種類、pH值、溫度、蛋白質質量分數等有著密切關系。

起泡度越大，表明體系起泡性能越強，失水率越低表示泡沫體系越穩定。腎豆分離蛋白起泡性及起泡穩定性受pH值、溫度及蛋白濃度影響見圖9，pH值對腎豆蛋白起泡能力影響較大，pH5.0時最低，pH9.0時最高，估計原因是pH值對于蛋白電荷及結構的影響，遠離等電點的pH值造成蛋白與水作用力強，起泡力和穩定性較高，但過高的pH值造成蛋白表面結構的變化使得起泡力減弱且失水率增高[13]。隨著溫度升高，蛋白起泡力逐漸增強，加熱有助于蛋白質伸展，利于形成泡沫，但是隨著溫度的升高，水分揮發加快、氣體膨脹、氣泡易破裂、泡沫易解體，所以體系泡沫穩定性變化較平緩泡沫體系穩定性降低。

起泡力、泡沫穩定性與分離蛋白質量分數正相關，質量分數越大起泡力越大泡沫體系越穩定、但5%質量分數以上，曲線變化趨勢較緩。

圖9 pH值、溫度、質量分數對腎豆分離蛋白起泡力及失水率的影響Fig.9 Effects of pH, temperature and protein concentration on foaming capacity and water loss rate of ASP extracted from kidney beans

2.5.5 乳化性(emulsifying activity index，EAI)及乳化穩定性(emulsification stability index，ESI)

pH值、溫度、質量分數對腎豆分離蛋白乳化能力的影響見圖10。蛋白質是兩性物質，隨著pH值的變化，蛋白分子表面的帶電情況及溶解度隨之變化，致使其乳化能力及乳化穩定性發生變化。在pH5.0時接近等電點，表現出乳化性最弱但乳化穩定性最高的特殊性，可能是由于在蛋白質的等電點蛋白質分子表面電荷為0，能吸附在油水界面的蛋白質少，但由于蛋白質間靜電排斥作用小促使蛋白質進一步在油水界面重排堆積，促進了高強度膜的形成，阻止油滴聚集上浮從而提高了乳狀液的穩定性[14]。之后隨pH值升高，遠離等電點，EAI升高，ESI值基本持平。

提高溫度有助于蛋白分子在溶液中構型展開，蛋白質分子吸收能量使內能增加，導致空間構型中部分化學鍵鍵斷裂，包含在球狀分子內疏水性基團外露，因而乳化能力增強，在20～60℃間，溫度升高對乳化性作用效果顯著，乳化性有較明顯提高，而60℃后，變化趨于平緩。乳化穩定性也隨溫度升高而增強。

EAI值隨分離蛋白質量分數升高而升高，在質量分數1%～5%范圍內影響顯著，當質量分數繼續升高至10%，增長趨緩，但ESI值持續升高。

圖10 pH值、溫度、質量分數對腎豆分離蛋白乳化能力的影響Fig.10 Effects of pH, temperature and protein concentration on emulsifying properties of ASP extracted from kidney beans

3 結 論

3.1 確定腎豆蛋白等電點為4.50，與多數植物蛋白質相似。

3.2 通過響應面分析法優化得出最佳工藝條件堿提pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取時間21.88min、提取溫度48.20℃，回歸模型預測提取率理論值達(17.98± 0.08)%。工藝條件經修訂為pH8.93、液料比10.67:1(mL/g)、提取時間22min、提取溫度48℃。在此條件下腎豆蛋白實際提取率為18.02%，實測值與回歸方程預測值吻合良好。

3.3 腎豆分離蛋白粉淡黃色、無異味，蛋白含量(82.41± 0.89)%，參照大豆蛋白粉國家標準，除水分含量稍偏高外，其余均在限值內。

3.4 腎豆分離蛋白持水性最低值在pH5.0，最高值在pH9.0，隨溫度升高而先升高后降低，60℃時為最大值。20℃時吸油性最差，之后隨溫度升高而增強。起泡及泡沫穩定性、乳化及乳化穩定性在pH5.0處表現特殊，起泡、乳化能力最低但泡沫穩定性、乳化穩定性最高。之后隨pH值升高起泡能力升高但泡沫穩定性有所降低，乳化能力及乳化穩定性升高。

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Optimization of Extraction Process and Functional Properties of Protein from Kidney Beans Grown in Qianjiang Region

XIONG Jia-yan1，DENG Li-ling1，FAN Chao-min1，ZOU Bo-yu1，ZHONG Geng1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400716, China；2. Chongqing Special Food Programme and Technology Research Center, Chongqing 400716, China)

In this study, the effects of pH, temperature, material-to-liquid ratio, and extraction time on the extraction rate of alkali-soluble protein (ASP) from kidney beans grown in Qiangjiang region were explored by one-factor-at-a-time design. The optimal process conditions for ASP extraction were determined by response surface methodology as pH 8.93, material-to-liquid ratio of 1:10.67, extraction time of 22 min, and extraction temperature of 48 ℃. The protein isolate obtained under these conditions was analyzed for functional properties such as water-holding capacity, oil-absorbing capacity, foaming properties and emulsifying properties.

kidney beans grown in Qiangjiang region；protein extraction；protein isolate；functional properties

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0025-07

2011-07-26

重慶高校優秀成果轉化項目(KJZH08221)

熊家艷(1991—)，女，碩士研究生，主要從事現代食品加工理論與技術研究。E-mail：xiongjiayan@163.com

*通信作者：鐘耕(1964—)，男，教授，博士后，主要從事糧食工程及現代食品加工理論與技術研究。E-mail：zhongdg@126.com