堿溶性東北山核桃蛋白的提取及SDS-PAGE分析

于陽陽，包怡紅*

(東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

堿溶性東北山核桃蛋白的提取及SDS-PAGE分析

于陽陽，包怡紅*

(東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以經超臨界CO2去除油脂后的東北山核桃仁渣為原料，利用堿提法對山核桃渣進行蛋白質提取，考察NaOH溶液濃度、料液比、提取溫度、提取時間4個因素對蛋白提取率的影響，并在單因素試驗的基礎上設計正交試驗，確定堿溶性山核桃仁蛋白最佳提取條件和其等電點。同時對堿溶性山核桃蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳分析。結果表明：當提取液NaOH濃度0.02mol/L、料液比1:30(g/mL)、提取溫度50℃、提取時間1.5h時，堿溶性山核桃蛋白提取率最大可達88.05%，其等電點為4.5。SDS-PAGE分析結果表明，堿溶性山核桃蛋白分子質量主要分布在100、60、36kD和20kD 四個區域。

山核桃；堿溶性蛋白；提取；SDS-PAGE；分子質量

東北山核桃即核桃楸(Juglans mandshurica)屬于胡桃科胡桃屬，又名胡桃楸、楸子或山核桃。主要分布于我國黑龍江大、小興安嶺，吉林，遼寧，內蒙古東部，河北，山西，河南等地[1]。

東北山核桃果仁中含有豐富的蛋白質、8種人體必需氨基酸酸、礦質元素、多種不飽和脂肪酸和維生素，而碳水化合物的含量較低[2]。東北山核桃屬純天然野生堅果類，與核桃相似，具有潤肺、強腎、降低血脂、預防冠心病的功能，長期食用能夠益壽養顏、抗衰老，孕婦食用對胎兒智力發育有很好的幫助[3-6]。

目前以東北山核桃為原料的研究，主要集中在其種仁中油脂的提取和功能方面。蘇玖玲等[7]研究了以山核桃為原料，利用有機溶劑法、超臨界CO2提取法和酶法提取油脂，得到最佳工藝條件，并對核桃油的穩定性和降血脂功能進行了初步分析。而以脫脂后的山核桃渣為原料，研究其蛋白質提取的報道還較少見。SDS電泳是測定蛋白質亞基分子質量的一種簡單、快速、可靠的方法，如大豆蛋白、白果蛋白、苦蕎麥蛋白等蛋白質的分子質量已經通過該方法測定[8-10]。

本實驗以粉碎后經超臨界CO2去除油脂的東北山核桃仁(即核桃渣)為原料，提取其堿溶性蛋白質，通過正交試驗確定最佳提取條件，同時確定堿溶性山核桃蛋白的等電點。并利用SDS電泳檢測出堿溶性山核桃仁蛋白質的分子質量分布。旨在為今后東北山核桃蛋白質的進一步科學研究和綜合利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

經過超臨界CO2脫脂的東北山核桃仁渣山核桃渣。SDS-PAGE電泳所用試劑、蛋白質電泳Marker等。

1.2 儀器與設備

DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；電泳自動成像儀美國BIO-RAD生化科技有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；T6新世紀紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；PB-10標準型酸度計 上海滬粵明科學儀器有限公司；凱氏定氮裝置。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將篩選好的山核桃仁粉碎后，經超臨界CO2萃取核桃油，操作條件為壓力35MPa、分離溫度40℃、時間4h[7]。脫脂后的山核桃渣過40目篩后備用，其中蛋白質含量測定采用微量凱氏定氮法[11]。

1.3.2 堿溶性山核桃蛋白提取率測定

準確稱取1.000g的脫脂山核桃渣→NaOH溶液提取→4000r/min，離心10min→上清液稀釋一定倍數后，采用福林-酚比色法[12]測定上清液蛋白含量。

1.3.3 堿溶性山核桃蛋白等電點測定

原料經堿溶液提取后，4000r/min，離心10min取上清蛋白液，加入0.1mol/L HCl溶液調pH值分別為2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8，混合均勻，靜置30min，4000r/min，離心10min，去上清液后，稱量下層沉淀質量，沉淀量最多的即為堿溶性山核桃蛋白的等電點[13]。

1.3.4 堿溶性山核桃蛋白提取的單因素試驗

以NaOH溶液為提取液，在固定提取工藝條件：提取溫度45℃、提取時間2h、料液比1:30(g/mL)、NaOH溶液濃度0.01mol/L情況下，分別考察NaOH溶液濃度0.0005、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1mol/L，料液比1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60，提取溫度35、40、45、50、55、60℃，提取時間1、1.5、2、2.5、3、3.5、4h對山核桃蛋白提取率的影響。

1.3.5 正交試驗

根據單因素試驗結果，以NaOH溶液濃度、料液比、溫度、時間為考察因素進行L9(34)正交試驗，試驗因素及水平見表1。

表1 堿溶性山核桃蛋白的提取工藝優化正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels tested in orthogonal array design

1.3.6 SDS-PAGE凝膠電泳試驗

采用電泳儀進行不連續雙垂直板聚丙烯酰胺凝膠電泳[14]。將山核桃蛋白提取液與樣品緩沖液(pH6.8、1mol/L Tris-HCl緩沖液1.6mL、甘油2.0mL、10% SDS 4.0mL、質量分數0.1%溴酚藍0.5mL、β-巰基乙醇1.0mL、去離子水定容至20mL)按1:1的體積比例混合，100℃煮沸5min，10000r/min，離心10min，上樣20μL，分離膠質量濃度12mg/100mL，濃縮膠質量濃度5mg/100mL。開始電壓80V，進入分離膠后110V，電泳時間2.5～3.5h。考馬斯亮藍R-250熱染20min，放入脫色液中搖床脫色，直至膠片背景藍色完全透明狀，電泳自動成像儀拍照。

2 結果與分析

2.1 樣品蛋白質含量

東北山核桃仁粉碎后經超臨界CO2在壓力35MPa、分離溫度4 0℃、時間4 h的條件下脫脂后得試驗樣品，樣品山核桃渣經凱氏定氮測得其粗蛋白質含量為55.032%。

2.2 堿溶性山核桃蛋白等電點測定

圖1 堿溶性山核桃蛋白質等電點Fig.1 Isoelectric point of alkali-soluble pecan proteins extracted from Juglans mandshurica Maxim kernel

由圖1可知，當pH值由2逐漸升高時，沉淀蛋白含量逐漸增加，pH4.5時，蛋白沉淀量最多為12.29mg。p H值繼續升高超過5.5時，蛋白沉淀量減少。當蛋白質處于等電點附近時，其溶解性較低，易沉淀，根據圖示結果，確定堿溶性山核桃蛋白的等電點為4.5。

2.2 堿溶性山核桃蛋白提取單因素試驗

2.2.1 提取液濃度對山核桃蛋白提取率的影響

圖2 NaOH溶液濃度對山核桃蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the extraction yield of alkalisoluble proteins

由圖2可知，隨著堿液濃度逐漸增加蛋白質提取率也隨之增加，堿液濃度增加至0.01mol/L時，蛋白質提取率增加較明顯，當堿液濃度0.05mol/L時提取率達到最大為85.379%，堿液濃度繼續增加，蛋白質提取率有下降趨勢。堿液濃度增加在一定范圍內可提高堿溶性蛋白的提取率，但濃度過高，可能會導致蛋白質結構改變而變性，使其提取率下降。同時，堿液濃度過大，使蛋白提取液堿性過強，限制了其利用范圍。綜合考慮，確定提取所用NaOH溶液的濃度為0.01mol/L。

2.2.2 料液比對山核桃蛋白提取率的影響

圖3 料液比對山核桃蛋白質提取率的影響Fig.3 Effect of material-to-solvent ratio on the extraction yield of alkali-soluble proteins

由圖3可知，隨著提取劑用量的增加，蛋白質提取率增加，當料液比為1:30時，蛋白質提取率達80.087%，提取劑用量繼續增加，蛋白質提取率增加不明顯。考慮到實際操作方便和成本問題，確定1:30為最佳料液比。

2.2.3 提取溫度對山核桃蛋白提取率的影響

由圖4可知，當提取溫度從35℃升高到45℃時，蛋白質提取率也隨之增加，溫度45℃時，蛋白質提取率最高為82.325%。但溫度繼續升高時，蛋白質提取率隨之下降，其原因是，高溫可導致蛋白質變性，溶解性降低。

圖4 提取溫度對山核桃蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of alkali-soluble proteins

2.2.4 提取時間對山核桃蛋白提取率的影響

圖5 提取時間對山核桃蛋白提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the extraction yield of alkali-soluble proteins

由圖5可知，隨提取時間延長，原料蛋白質提取率增加，1.5h達到最大為83.034%，提取時間繼續延長，可能由于作用時間過長而導致蛋白質變性，使其提取率下降。所以，確定最佳提取時間為1.5h。

2.3 山核桃蛋白質提取工藝優化正交試驗

表2 山核桃蛋白質提取工藝優化正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design and corresponding results

由表2可知，影響山核桃蛋白提取率的因素主次順序為A(NaOH溶液濃度)＞B(料液比)＞D(提取時間)＞C(提取溫度)。最佳提取山核桃蛋白的工藝為A3B2C3D2，即在NaOH溶液濃度0.02mol/L、料液比1:30、提取溫度50℃、提取時間1.5h條件下，山核桃蛋白的提取率最大。在最佳提取工藝條件進行驗證實驗，山核桃蛋白質平均實際提取率為88.05%。

2.4 SDS-PAGE凝膠電泳試驗結果

圖6 堿溶性山核桃蛋白的SDS-PAGE圖Fig.6 SDS-PAGE of alkali-soluble pecan proteins extracted from Juglans mandshurica Maxim kernel

由圖6可知，電泳結果條帶清晰，可以看出來堿溶性山核桃蛋白分子質量較低，主要為100、60、36、20kD。Labuckas等[15]對核桃蛋白的研究結果發現：利用0.1mol/L Na2B4O7提取的蛋白質分子質量條帶清晰可見，而利用0.1mol/L NaOH溶液提取的蛋白質分子質量基本在100kD以下，但是電泳條帶彌散不清，不能確定具體分子質量大小。可見不同提取液及提取液濃度均可導致得到的蛋白質分子質量的不同。

3 結 論

本實驗以經超臨界CO2去除油脂后的東北山核桃渣為原料，利用堿提法對山核桃渣進行蛋白質的提取，根據單因素和正交試驗結果可知，影響山核桃蛋白提取率的因素主次順序為A(NaOH溶液濃度)＞B(料液比)＞D(提取時間)＞C(提取溫度)。堿溶性山核桃仁蛋白最佳提取條件為NaOH溶液濃度0.02mol/L、料液比1:30、提取溫度50℃、提取時間1.5h，此條件下堿溶性山核桃蛋白提取率最大為88.05%。通過試驗確定堿溶性山核桃蛋白質等電點為4.5。對堿溶性山核桃蛋白進行SDS-PAGE分析，結果表明，其分子質量主要分布在100、60、36kD和20kD 四個區域。

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Extraction and SDS-PAGE Analysis of Alkali-Soluble Proteins fromJuglans mandshuricaMaxim Kernels

YU Yang-yang，BAO Yi-hong*
(School of Forestry, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

The extraction of alkali-soluble proteins fromJuglans mandshuricaMaxim kernel waste left over after oil extraction with supercritical carbon dioxide was optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The effects of NaOH concentration, material-to-solvent ratio, temperature and extraction time on the extraction yield of protein. It was found that the highest extraction yield of protein, 88.05%, was obtained after 1.5 h of extraction with 0.02 mol/L NaOH solution at a material-to-solvent ratio of 1:30 and 50 ℃. The isoelectric point of the extract obtained under these conditions was measured to be 4.5. SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight distribution of alkali-soluble proteins fromJuglans mandshuricaMaxim kernels was mainly 100, 60, 36 kD and 20 kD.

Juglans mandshuricaMaxim；alkali-soluble protein；extraction；SDS-PAGE；molecular weight

TS201.1

A

1002-6630(2012)18-0010-04

2011-07-09

中央高校基金項目(LD09C14)

于陽陽(1986—)，女，碩士研究生，研究方向為功能性食品及植物資源深加工與利用。

E-mail：yuyangyang.1986@163.com

*通信作者：包怡紅(1970—)，女，教授，博士，研究方向為天然產物生物轉化、功能性食品。E-mail：baoyihong@163.com