高效液相色譜法測定西蘭花中蘿卜硫素的研究

顧穎娟，張 亮，鄒 宇，陳志剛，韓永斌，顧振新

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095)

高效液相色譜法測定西蘭花中蘿卜硫素的研究

顧穎娟，張 亮，鄒 宇，陳志剛，韓永斌，顧振新*

(南京農業大學食品科技學院，江蘇南京 210095)

建立了采用高效液相色譜法(HPLC)測定西蘭花種子及芽苗中蘿卜硫素的方法。具體方法為:采用反相XDB－C18色譜柱分離，乙腈－水梯度(10%－60%－100%，0－25－30min)洗脫，流速0.6mL/min，檢測波長254nm，進樣量50μL。蘿卜硫素測定結果的相對標準偏差小于1%，平均回收率達到97.14%。該方法具有較好的分離效果和較高的穩定性，適用于西蘭花中蘿卜硫素含量的測定。

西蘭花，高效液相色譜法，蘿卜硫素，測定

西蘭花(Brassica oleracea var.italics)系十字花科蕓薹屬蔬菜，它的種子和植株中均含有硫苷，在內源酶作用下可水解得到異硫氰酸酯類物質，其中以蘿卜硫素(1－異硫氰基－4－甲基亞磺?；⊥?，sulforaphane)最受人們關注［1－2］。目前，蘿卜硫素被認為是最有效的植物源抗癌活性物質之一［2］。它能誘導機體產生II型解毒酶，通過提高機體代謝致癌物和抗氧化能力，誘導癌細胞程序性凋亡并起到化學防癌功能。蘿卜硫素分子結構中－N=C=S基團具有很強的親電子能力，與氨基、羥基、硫醇、β－羰基、羧酸等親核試劑發生加成反應，生成相應的硫脲［2］。早期用于檢測蘿卜硫素含量的方法主要有硝酸銀滴定法、對羥基汞基苯甲酸滴定法［3］、哌啶滴定法、嗎啉滴定法、紫外分光光度法等［4］。此外，也可通過釋放蘿卜硫素結構中的S并采用硫酸鋇沉淀法［5］檢測微量的蘿卜硫素。目前，常見的蘿卜硫素的分析方法主要有薄層色譜法(TLC)、紙色譜法(PC)和氣相色譜法(GC)等。這些方法都存在不同程度的局限性，如薄層色譜和紙色譜法操作繁瑣、耗時長、重復性差;氣相色譜法的高溫條件會使蘿卜硫素部分降解，導致結果不準確［6－8］。HPLC法已被證明是一種檢測西蘭花中蘿卜硫素含量的有效方法，但在提取步驟、分離效果以及檢測靈敏度和回收率等方面仍需改進［9－12］。本實驗針對以上問題，對HPLC法測定蘿卜硫素的提取方法、色譜柱和色譜條件等進行了研究，旨在建立一種簡單、快速、精密的蘿卜硫素測定方法，為富含蘿卜硫素芽苗食品的質量控制和綜合開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西蘭花種子 購自南京金盛達種子公司，品種為綠領香80d;蘿卜硫素 標準品，CAS號:4478－93－7，Sigma公司;甲醇 色譜純，南京化學試劑有限公司;其余化學試劑 上海國藥集團。

液相色譜儀 Agilent1200 美國安捷倫公司; DZF－6020型真空干燥器 上海一恒科技有限公司; LG10－2.4A型高速離心機 北京醫用離心機廠; ZFA－1型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液配制 取5mg蘿卜硫素標準品，準確定容至10mL的10%乙腈中，得濃度為0.5mg/mL的蘿卜硫素標準品溶液。再分別配制濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的蘿卜硫素標準液，4℃保存一個月。

1.2.2 蘿卜硫素提取 西蘭花種子在無光照條件下發芽48h，經冷凍干燥后研成粉末。取樣品1.0g，用5mL正己烷脫脂3次，揮干，加入3mL去離子水，混勻后35℃水浴2h，加入1g氯化鈉，用等體積的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液并35℃旋轉蒸發至黃油狀液體(或蒸干)，用1mL 10%乙腈溶解殘留液，過0.45μm濾膜，待用。

1.2.3 色譜條件 采用反相SB－C18或反相XDB－C18色譜柱分析，乙腈－水梯度洗脫，流速0.6mL/min，檢測波長254nm。乙腈－水梯度洗脫時，采用以下3種參數:30%－80%－100%，0－10－12min，乙酸乙酯為溶劑;40%－100%，0－20min，乙酸乙酯為溶劑;10%－60%－100%，0－25－30min，溶劑為10%乙腈。

2 結果與分析

2.1 色譜柱和色譜條件的選擇

2.1.1 SB－C18色譜柱分析 反相SB－C18色譜柱適用在低pH下分離蛋白質、多肽、維生素類物質等，具有較寬的pH適用范圍，常用于酸性、堿性和極性化合物的分離。SB－C18色譜柱具有親水性表面，可以有效地防止固定相的塌陷，在高水分含量流動相中有強保留作用。本研究采用兩種不同的乙腈－水梯度洗脫方法(0%－80%－100%，0－10－12min和40%－100%，0－20min)，蘿卜硫素標準品分離效果較為理想(圖1、圖2)，但是，兩種洗脫方法均未將西蘭花種子和芽苗中的蘿卜硫素與其他硫代葡萄糖苷水解產物分離開。

2.1.2 XDB－C18色譜柱分析 反相XDB－C18色譜柱主要適用于中性及酸性化合物的分離，可在pH 2～9的寬pH范圍內提供良好的峰形。采用10%乙腈水溶液溶解種子和芽苗萃取物，采用反相XDB－C18色譜柱分離，流動相組成為乙腈和水，梯度洗脫，濃度范圍為10%－60%－100%，洗脫時間為0－25－30min，流速為0.6mL/min，紫外檢測器254nm，蘿卜硫素出峰時間為15.5min(圖3)。實驗結果表明，采用以上色譜柱和色譜條件，可從硫代葡萄糖苷的酶解液中分離出多種化合物，無拖尾、肩峰等現象，可有效的將西蘭花種子和芽苗中的蘿卜硫素與其他硫代葡萄糖苷水解產物分離開，可用于西蘭花中蘿卜硫素的分析測定。

2.2 標準曲線制作

采用XDB－C18色譜柱層析分離，以蘿卜硫素質量為橫坐標，峰面積為縱坐標，制作蘿卜硫素HPLC標準曲線，得回歸方程為y=519.81x，R2=0.9999，蘿

圖1 反相SB－C18色譜柱分析蘿卜硫素Fig.1 Sulforaphane analysis with reversed SB－C18column

圖2 反相SB－C18色譜柱分析蘿卜硫素Fig.2 Sulforaphane analysis with reversed SB－C18column

2.3 回收率實驗

加標回收率實驗(表1)表明，蘿卜硫素的平均回收率為97.14%，RSD為2.94%(n=3)，表明該方法具有較高的加標回收率。

表2 精密度檢驗Table 2 Precision inspection

圖3 XDB－C18色譜柱分離檢測蘿卜硫素Fig.3 Separation and detection of sulforaphane with XDB－C18column

圖4 蘿卜硫素HPLC峰面積標準曲線Fig.4 Standard curve of sulforaphane HPLC peak area

表1 加標回收實驗Table 1 Spiked recovery experiment

2.4 精密度實驗

精密度實驗結果(表2)表明，對不同濃度的樣品，RSD小于1%(n=6)，表明該方法精密度較好。

3 結論

采用HPLC法檢測西蘭花種子中蘿卜硫素含量雖有報道，但缺陷依然明顯。由于有機溶劑從西蘭花種子酶解液中萃取蘿卜硫素時存在脂肪、糖類、可溶性蛋白、色素和其他硫苷水解物等干擾，導致分離效果差、基線過高等問題。本研究采用多次液－液萃取純化技術對西蘭花種子及芽苗樣品進行預處理，提取西蘭花種子及芽苗中蘿卜硫素。在此基礎上，選用反相XDB－C18色譜柱對含蘿卜硫素的10%乙腈提取液進行定性定量測定，取得了較好的分析結果。該方法不僅適用于西蘭花種子及芽苗中蘿卜硫素的分析，也可用于硫苷酶解物中其他組分的分析。

［1］Fenwick GR，Heaney RK，Mullin WJ.Glucosinolates and their breakdown products in food and food plants［J］.Critical Reviews in Food Science and Nutrition，1983，18:123－201.

［2］Zhang Y，Kensler TW，Cho CG，et al.Anticarcinogenic activitiesofsulforaphane and structurally related synthetic norbornyl isothiocyanates［J］.Process of the National Academy of Sciences of the United States of America，1994，91(8):3147－3150.

［3］Nakamura Y，Miyoshi N.Electrophiles in foods:The current status of isothiocyanates and their chemical biology［J］.Bioscience Biotechnology and Biochemistry，2010，74(2): 242－255.

［4］Josefsson E.Method for quantitative determination of phydroxybenzyl isothiocyanate in digests of seed meal ofSinapis albaL.［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1968，19(4):192－194.

［5］姜子濤，李榮.快速測定芥末油中ITCs的含量［J］.中國調味品，1992(8):29－30.

［6］Raghavan B，Shankaranarayana ML，Nagalakshmi S，et al.Volumetric determination of p－hydroxybenzyl isothiocyanate in sinalbin(p－hydroxybenzylglucosinolate)and in white mustard seed(Sinapis AlbaL)［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1971，22(10):523－525.

［7］胡曄，梁浩，袁其朋.十字花科植物種子中萊菔硫烷的薄層色譜鑒別［J］.北京化工大學學報，2006，33(2):33－36.

［8］吳元峰，毛建衛，袁海娜，等.氣質聯用分析蕓苔屬種子水解液中的異硫氰酸鹽［J］.分析實驗室，2008，27(9):53－56.

［9］吳元鋒，沈蓮清，毛建衛，等.蕓苔屬植物種子中蘿卜硫素的提取工藝研究［J］.食品與生物技術學報，2009，28(5): 647－651.

［10］Liang H，Yuan QP，Dong HR，et al.Determination of sulforaphane in broccoli and cabbage by high－performance liquid chromatography［J］.Journal of Food Composition and Analysis，2006，19(5):473－476.

［11］Bertelli D，Plessi M，Braghiroli D，et al.Separation by solid phase extraction and quantification by reverse phase HPLC of sulforaphane in broccoli［J］.Food Chemistry，1998，63(3): 417－421.

［12］Nakagawa K，Umeda T，Higuchi O，et al.Evaporative lightscattering analysis of sulforaphane in broccoli samples:Quality of broccoli products regarding sulforaphane contents［J］.Journal of agricultural and food chemistry，2006，54(7):2479－2483.

Study on determination method of sulforaphane in broccoli by HPLC

GU Ying－juan，ZHANG Liang，ZOU Yu，CHEN Zhi－gang，HAN Yong－bin，GU Zhen－xin*(College of Food Science and Technology，Nanjing Agricultural University，Nanjing 210095，China)

A high performance liquid chromatograph(HPLC)method had been set up for determination of content of sulforaphane in broccoli seeds and buds.The chromatographic separation was achieved on reversed XDB－C18using acetonitrile－water as the mobile phase(10%－60%－100%，0－25－30min)at a flow rate of 0.6mL/min.The detector wavelength was set at 254nm and the injection volume used was 50μL.The relative standard deviation of sulforaphane content determinated was less than 1%and the average recovery was 97.14%.This method showed good separation effect and high stability，and could be used for determining the content of sulforaphane in broccoli.

broccoli;HPLC;sulforaphane;determination

TS255.1

A

1002－0306(2012)04－0080－04

2011－03－01 *通訊聯系人

顧穎娟(1988－)，女，碩士研究生，研究方向:食品中功能成分的富集技術。

江蘇省科技支撐計劃項目(BE2006309)。