口服PHA復合物對犬瘟熱疫苗免疫效果的影響

郭守興 （云南省普洱市景谷縣動物衛生監督所 666400） 沈學文 （云南省紅河州動物疫病預防控制中心 蒙自） 肖嘯 （云南農業大學動物科學技術學院 昆明）

?

口服PHA復合物對犬瘟熱疫苗免疫效果的影響

郭守興 （云南省普洱市景谷縣動物衛生監督所 666400） 沈學文 （云南省紅河州動物疫病預防控制中心 蒙自） 肖嘯*（云南農業大學動物科學技術學院 昆明）

試驗通過選擇12只健康幼犬，隨機分成對照組和試驗組，每組6只。試驗當天進行免疫接種，試驗組每只皮下注射1頭份犬瘟熱-犬細小二聯苗，同時口服PHA復合物0.1mg/kg，對照組每只皮下注射1頭份二聯苗。各組在接種前及接種后7、14d，分別采血用CDV-Ab金標試紙條測定其抗體滴度，計算陽轉率并進行T檢驗：接種后7d，對照組陽轉率為33.3%，試驗組陽轉率為66.7%，試驗組與對照組相比，陽轉率提高約2倍；接種后14d，對照組抗體滴度平均水平為1:22.5，試驗組抗體滴度的平均水平為1:45。對照組陽轉率為66.7%，試驗組陽轉率為83.3%，試驗組比對照組相提高了16.6%。T檢驗結果顯示，試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間波動。試驗表明：PHA復合物可明顯提高幼犬對犬瘟熱疫苗的抗體應答能力，是一種良好的犬瘟熱疫苗免疫增效劑。

PHA復合物 犬瘟熱疫苗 免疫效果

植物血凝素(phytohaemagglutinin,PHA)是一種從紅蕓豆中提取的有絲分裂原，是由D-甘露糖、氨基葡糖醛酸衍生物所構成的低聚糖輔基與蛋白質復合物，PHA有促進淋巴細胞有絲分裂、激活淋巴細胞的作用。是一種干擾素誘導劑，不僅可以刺激機體產生白介素-2和干擾素，還可以刺激機體產生非特異性抗體[1]。據美國《Science》雜志報道，機體免疫系統通過識別PHA而識別病毒，并產生相應的抗體和其他免疫反應，以從體內清除病毒[2]。PHA與黃芪多糖等多種中草藥聯用具有增效作用，與部分抗生素聯用具有相加作用。植物血凝素作為天然的免疫細胞激活劑具有毒副作用小、安全范圍大、無種屬特異性、不易產生耐藥性、不易產生過敏反應、無殘留、生物利用率較高的特點[3]。

由于PHA強大的增強機體非特異性免疫力的作用以及強效的抗病毒作用，其作為一種新型的天然廣譜抗病毒藥物在畜牧養殖業中應用廣泛。在獸藥中的應用也日益廣泛。

PHA也具有多種免疫效應：能刺激多種淋巴細胞分裂增殖，是多克隆激活劑；能促進淋巴細胞釋放細胞因子，如IFN-γ、IL-2等；同時PHA可促進抗體形成，這些結果證明PHA具有強大的免疫增強作用[4]。

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(Canine distemper virus，CDV)引起的急性、高度接觸傳染性、致死性傳染病，是當前影響養犬業發展的最嚴重的第一大傳染病。幼犬出生8周左右，其血清中的抗體滴度大多已經低于免疫保護所需要的水平，必須盡快接種犬瘟熱疫苗。接種犬瘟熱疫苗后一般需要2周才能達到免疫保護所需要的中和抗體水平。幼犬在出生8周左右最易感染犬瘟熱，為使幼犬接種犬瘟熱疫苗后盡快產生抗體并達到免疫保護所需要的抗體水平，以及縮短幼犬易感期，特進行了此試驗。

目前，有關口服PHA對犬瘟熱病毒免疫效果影響的研究鮮見報道，本試驗通過對健康犬注射犬瘟熱-犬細小二聯苗，同時口服PHA復合物，測定犬免疫效果的變化，以研究PHA是否對犬瘟熱病毒免疫效果產生影響，以期為PHA在動物方面的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物 本次試驗所用的12只健康犬均由康大媽流浪狗收容所提供，所有接種疫苗的犬均無過往疾病史，精神狀態良好，經檢測抗體水平符合接種條件，不符合的均已被剔除。試驗前、后均按正常方式飼養，環境、飼料不變。

1.1.2 試驗藥物 PHA復合物(云南大理金明動物藥業有限公司生產，生產批號20100101)、犬瘟熱-犬細小二聯苗(荷蘭英特威公司生產，生產批號A063A01)。

1.1.3 試驗儀器及試劑 真空貯血管(5ml，無抗凝，江西格蘭斯醫療器械有限公司)；采血針(江西洪達醫療器械集團有限公司)；離心機(上海手術器械廠)；CDV-Ab金標試紙條(韓國安捷公司，內有稀釋緩沖液1瓶，吸液塑料管1支)

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組 將12只年齡、體重相近的健康犬隨機分成對照組和試驗組2組，每組6只。試驗組提前1周喂服PHA復合物0.1mg/kg體重，1次/d，連續給藥5d，1周后，試驗組與對照組同時接種免疫，每只試驗犬皮下注射1頭份英特威二聯苗，疫苗接種后試驗組繼續投藥，方法劑量與前次相同，連用5d，1周后，再按之前的方法再次給藥5d。整個過程，對照組均不做給藥處理。各試驗犬均按正常方式管理、飼喂。

1.2.2 血樣的采集和處理 試驗為期3周，各組在免疫接種前及接種后7、14d，分別前肢靜脈采血3ml，將所采血樣分組編號，用離心機4000轉離心5min，分離出血清。

1.2.3 抗體滴度的測定 血清處理后用CDV-Ab金標試紙條測定其抗體滴度：用包裝內的塑料吸管吸取適量血清，滴入稀釋緩沖液中，混合均勻，吸取混合液，在試紙條的加樣孔里滴加3至4滴，室溫靜置20min，比較T線與C1、C2線的線條寬度與顏色深淺(注釋：稀釋緩沖液中含有少量的疊氮鈉作為防腐劑，該藥物有毒性，必須小心處理并且避免皮膚接觸)。

1.2.4 試驗結果判定 CDV-Ab金標試紙條判定：①C1線為低抗體水平測量對照線，抗體水平相當于1:16，C2為高抗體水平測量對照線，相當于1:128的抗體水平。②如果T線的線條寬度和顏色深淺弱于C1線，那血清的抗體水平判定就以C1為準，具體方法是：如果T線不出現，則該血清抗體水平為0，如果T線線條寬度和顏色深淺是C1線的1/4，則抗體水平為1:2，是C1線的1/3則抗體水平為1:4，是C1線的1/2時，抗體水平為1:8，如果與C1相近則為1:16。③如果T線的線條寬度和顏色深淺強于C1線而弱于C2線，則該血清的抗體水平判斷就以C2線為準，具體方法是：如果T線線條寬度和顏色深淺是C2線的1/3，則抗體水平為1:32，如果是1/2，則抗體水平為1:64，如果與C2相近則為1:128，其中1:32的抗體水平為臨界值，1:64以上為合格。

1.2.5 數據分析 采用SPSS統計軟件，按照生物統計學上的分析方法對檢測的各組數據進行統計學處理和分析，P<0.05表示差異顯著和P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 接種前對照組和試驗組的抗體滴度水平

表1 接種前對照組組與試驗組組的抗體滴度水平

由表1可知，接種犬瘟熱-犬細小二聯疫苗前，對照組與試驗組犬的抗體滴度水平基本相同，平均值皆為1:3，兩組的犬瘟熱抗體陽轉率都為0。T檢驗顯示兩組間差異不顯著(P>0.05)。

2.2 免疫接種后7d對照組和試驗組的抗體滴度水平

表2 免疫接種后7d各組的抗體滴度水平

由表2可知，接種疫苗后7d，試驗組抗體滴度的平均水平達到1:29.5，比對照組提高了48.14%。對照組陽轉率為33.3%，試驗組陽轉率為66.7%，試驗組與對照組相比，陽轉率提高約2倍。T檢驗結果顯示，試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.3 免疫接種后14d對照組和試驗組的抗體滴度水平

接種疫苗后14d，對照組抗體滴度平均水平為1:22.5，試驗組抗體滴度的平均水平達到1:45。對照組陽轉率為66.7%，試驗組陽轉率為83.3%，試驗組比對照組相提高了16.6%(見表3)。T檢驗結果顯示試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間。

表3 免疫接種后14d各組的抗體滴度水平

3 討論

據報道，目前有許多研究表明PHA可以與疫苗同時使用，能起到彌補免疫空白期、減緩疫苗應激反應、增強免疫效果的作用。莫非等人研究了植物血凝素(PHA)對雞免疫功能的影響，結果表明PHA對機體的細胞免疫和體液免疫均有較強的促進作用，PHA對人工感染雞新城疫病毒有保護力[5]。陳東明等(2006)[6]報道利用PHA增強了小鼠特異性體液免疫的效應。張明珠等(2009)[7]在試驗植物血凝素對雞新城疫疫苗免疫效果的影響中，采用滴鼻的途徑，對肉用雛雞進行新城疫Ⅳ系苗免疫接種過程中，同時輔助使用植物血凝素(PHA)，可明顯提高機體特異性抗體的水平，因而能夠有效地增強雞新城疫疫苗的免疫效果。

通過對健康犬注射犬瘟熱-犬細小二聯苗，同時口服PHA復合物，測定犬免疫效果的變化，發現在免疫接種前2組抗體滴度水平基本相同，無免疫保護作用。接種疫苗后7d，對照組陽轉率為33.3%，試驗組陽轉率為66.7%，試驗組與對照組相比，陽轉率提高約2倍。試驗組抗體滴度的平均水平比對照組提高了48.14%。到免疫接種后14d，試驗組抗體滴度的平均水平為1:45，達到了保護犬免受犬瘟熱病毒感染所需的基礎抗體滴度水平(1:32)。陽轉率試驗組與對照組相比提高了16.6%，且T檢驗結果顯示，試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。試驗組抗體離散度縮小，在1:64~1:128之間。這表明給犬免疫注射犬瘟熱-犬細小二聯苗的同時，口服0.1mg/kg PHA復合物，可促進機體對疫苗株感染做出免疫應答，對幼犬抵抗犬瘟熱病毒的攻擊可能起到積極的預防作用，由此顯示PHA可以作為高效免疫增強劑與疫苗合用來提高疫苗的免疫效果。

接種疫苗后14d，對照組陽轉率為66.7%，試驗組陽轉率為83.3%，效果不明顯，為了加強免疫效果還要進行二免，甚至三免。提高幼犬對犬瘟熱病毒病的抵抗力。

肖嘯等(2011)[8]給不同試驗組豬肌注低劑量(0.2ml/kg)、中劑量(0.4ml/kg)、高劑量(0.8ml/kg)的PHA，結果發現，與對照組相比，低劑量組和中劑量組淋巴細胞都有了不同程度的提高，但中劑量組提高的較高，顯示適量的PHA能顯著地促進淋巴細胞提高，增強免疫功能。另有學者報道，PHA對雞新城疫，豬圓環病毒病、豬傳染性胃腸炎、非典型豬瘟等有免疫促進作用[9,10]，與本研究的結果基本一致。在實際免疫中，為更好地抵御犬瘟熱病毒的感染，還需要在首次免疫后的2~3周進行加強免疫。本試驗因條件限制，未能開展攻毒和中和試驗，以及不同劑量梯度的對比試驗，所以對免疫保護時間能提前多少天，最適宜的口服劑量等問題，還有待進一步研究。

4 結論

（1）對犬注射犬瘟熱-犬細小二聯苗，同時口服一定劑量PHA復合物，能極顯著提高機體抗體滴度水平，陽轉率也得到較大提高，且離散度明顯縮小，免疫效果更好。（2）給犬免疫注射犬瘟熱-犬細小二聯苗，同時口服PHA復合物，可促進機體對疫苗株感染做出免疫應答，對犬抵抗犬瘟熱病毒的攻擊可能起到積極的預防作用，由此顯示PHA可以作為高效免疫增強劑與疫苗合用來提高疫苗的免疫效果。

[1] 廖延雄. 獸醫微生物試驗診斷手冊[M]. 北京: 中國農業出版社, 1995.

[2] 王建發, 張敏, 林玉才. 植物血凝素的研究應用[J]. 北方牧業, 2008(8): 28.

[3] 胡業華. 凝集素的生物學研究[J]. 江西教育學院學報: 自然科學版, 2001, 22(6): 47-49.

[4] 于敏, 袁萍萍, 章瑩瑩等. 植物凝集素的部分生物學作用分析[J]. 安徽農業科學, 2002, 30(1): 155-156.

[5] 莫菲, 許巧麗, 張軍忍等. 植物血凝素對雞免疫功能的影響[J]. 甘肅農業大學學報, 2009, (1): 36-40.

[6] 陳東明, 邵嘉會.分子佐劑PHA增強小鼠特異性體液免疫的效應[J]. 青海師范大學學報, 2006, 17(6): 340-342.

[7] 張明珠, 汪仁莉, 蘆葦. 植物血凝素對雞新城疫疫苗免疫效果的影響[J]. 畜牧與飼料科學,2009,5(1):130-132.

[8] 肖嘯, 張榮華, 沈學文等.肌注PHA對豬血清中淋巴細胞(LY)的影響[J]. 上海畜牧獸醫通訊, 2011, (1): 17-19.

[9] 李秦, 許英民. 植物凝集素在獸醫臨床上的應用[J]. 獸藥市場指南, 2009, 4: 35-35.

[10] 于敏, 袁萍萍, 章瑩瑩等. 植物凝集素的部分生物學作用分析[J].安徽農業科學, 2002, 30(1): 155-156.

（2011–11–03）

云南省高端科技人才引進計劃項目子項目，項目編號2009C11256，云南省教育基金項目

S853.76

A

1007-1733(2012)02-0005-03