副溶血性弧菌免疫磁珠的制備及其應用

蘇晨曦，孫曉紅，*，盧 瑛，趙 勇，Vivian C H Wu，潘迎捷

(1.上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306;2.美國緬因大學食品科學與人類營養系，美國緬因 04469)

副溶血性弧菌免疫磁珠的制備及其應用

蘇晨曦1，孫曉紅1，*，盧 瑛1，趙 勇1，Vivian C H Wu2，潘迎捷1

(1.上海海洋大學食品學院，上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306;2.美國緬因大學食品科學與人類營養系，美國緬因 04469)

研究比較了不同的免疫磁珠(Immunomagnetic Beads，IMBs)富集捕獲副溶血性弧菌的能力。采用兩種副溶血性弧菌多克隆抗體，分別包被經羧基和甲苯磺酰胺基基團修飾的磁珠，制備完成5個免疫磁珠(IMB－C1、IMB－C2、IMB－T1、IMB－T2和IMB－T3)。研究引入表面抗體濃度作為評價免疫磁珠捕獲能力的特征性參數，兩種副溶血性弧菌多克隆抗血清包被的羧基磁珠表現出了較高的表面抗體結合能力，分別為34.25fg/μm2和36.73fg/μm2，明顯高于甲苯磺酰胺基磁珠。五個免疫磁珠對副溶血性弧菌捕獲能力的研究結果表明:在起始菌液濃度為4.32logCFU/mL時(p＜0.05)，兩個羧基磁珠捕獲率達到79%和94%，均優于甲苯磺酰胺基磁珠。采用環介導恒溫擴增(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)技術對免疫磁珠菌體細胞復合物進行體外擴增，結果表明:磁珠的存在并未影響對菌體細胞的后續分子檢測。本研究分析比較了不同免疫磁珠的捕獲能力，得到羧基磁珠對副溶血性弧菌的捕獲能力比甲苯磺酰胺基磁珠強，直接法和間接法偶聯方式對免疫磁珠的富集捕獲能力無影響。

副溶血性弧菌，免疫磁珠，環介導基因恒溫擴增技術，羧基，甲苯磺酰胺基

副溶血性弧菌是常見的食源性致病菌之一，該菌廣泛存在于海產品中，人一旦食用，容易引起腹瀉、腸痙攣、惡心、嘔吐、發熱等典型胃腸道反應［1］。目前由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件在數量上已經超越沙門氏菌躍居首位，特別是一些沿海城市，由該菌引起的食物中毒占細菌性食物中毒的比例高達60%以上［2－4］。因此，對副溶血性弧菌的檢測是食品安全檢測的重要內容，如在進出口水產品檢測的項目中，在飲用水、食品檢測和食品中毒源、傳染病源調查等工作中，都需要對該菌進行檢測［5］。傳統的微生物培養鑒定方法是實驗室經典常規的檢測鑒定方法，但因其操作繁瑣，耗時長等缺點不能滿足對食品中副溶血性弧菌進行快速準確檢測的要求。近年來隨著分子生物學的發展，PCR，DNA探針等技術已廣泛應用于副溶血性弧菌的檢測中，縮短檢測時間，并大大提高檢測靈敏度。但是分子生物學檢測技術都需要經過樣品的前處理－增菌階段，這不僅耗費大量的檢測時間，而且樣品組織殘渣或抑制性因子也會影響分子技術的檢測效率［6］。免疫磁珠分離技術(Immunomagnetic Separation，IMS)通過由載體微球和免疫配基共價偶聯而成的免疫磁珠特異性吸附靶目標，直接從樣品中或前增菌培養物中分離目的細菌［7］。目前，IMS技術已經廣泛應用于微生物富集捕獲的研究中，該方法能有效的對樣品中的目標菌進行捕獲，起到富集濃縮的作用，從而大大縮短前增菌時間，縮小初篩目的菌的范圍，提高檢測的靈敏度和特異性［8－10］。目前，應用免疫磁珠對副溶血性弧菌進行富集捕獲的研究多見于應用領域，如:Hara－Kudo等利用IMS和顯色培養基分離貝類中產TDH的副溶血性弧菌 O3:K6［11］。Datta 等［12］利用副溶血性弧菌ATCC17802制備針對極鞭毛的單克隆抗體，快速檢測從環境來源的副溶血性弧菌。張凡非等［13］利用IMS分離環境及食品樣品中的副溶血性弧菌。據國際上報道［14－15］，不同的化學連接鍵對免疫磁珠富集捕獲效果有影響，但國內無相關報道。本研究通過分析比較不同化學修飾和不同偶聯方式的副溶血性弧菌免疫磁珠的捕獲能力，獲得副溶血性弧菌捕獲效率最高的IMBs，為水產品中副溶血性弧菌的快速檢測提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副溶血性弧菌ATCC33846 中國科學院微生物菌種保藏中心;SD－100羧基磁珠(IMB－C) 上海奧潤微納新材料科技有限公司;Dynabeads? M－280 Tosylactivated(IMB－T) Invitrogen公司;羊抗兔IgG SIGMA公司;副溶血性弧菌多克隆抗體 上海友科生物科技有限公司;硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養基(TCBS)和胰蛋白胨大豆肉湯培養基(TSB) 北京陸橋技術有限責任有限公司;新西蘭大白兔 西普爾必凱公司;Bst DNA Polymerase NEB公司;硫酸鎂、脫氧核苷三磷酸(dNTP)、Tween－20 上海sigma生物科技有限公司;小牛血清白蛋白 Solarbio公司;其他試劑均為分析純。

隔水式恒溫培養箱、DK－8D型電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;HS－3垂直混合器 寧波新芝生物科技股份有限公司;DYY－6C電泳儀 北京市六一儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的培養 從斜面上挑取一環接種于液體培養基 TSB中，37℃，180r/min搖床培養12h，再取10μL轉接新鮮的TSB培養液，37℃，180r/min搖床培養12h。

1.2.2 多抗的制備 取副溶血性弧菌ATCC33846新鮮菌液，紫外燈下滅活處理后，免疫新西蘭大白兔，間接ELISA檢測血清，待效價＞1∶4000，終止免疫，10d后取血。采用硫酸銨多步沉淀法純化兔抗血清，得到抗血清R2。

1.2.3 免疫磁珠的制備 羧基磁珠的偶聯采用碳二亞胺/N－羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)活化羧基，加入經過純化的抗血清R2在室溫下反應3h，制備得到免疫磁珠，標示為IMB－C2。采用上海友科公司采購的抗血清R1作對比研究，制備得到免疫磁珠，標示為IMB－C1。甲苯磺?；胖椴捎脙煞N包被方式:直接法和間接法。直接法，即將抗血清R1和R2溶液分別包被磁珠，室溫下反應18h，制備得到免疫磁珠，分別標示為IMB－T1和IMB－T2;間接法，即先將磁珠與羊抗兔IgG溶液混合，室溫下進行包被反應3h后再與抗血清R2室溫下連接18h，制備得到的免疫磁珠，標示為IMB－T3，采用Bradford法檢測偶聯抗體后上清液中抗體濃度，計算得到偶聯抗體率［16］。

1.2.4 目的菌的捕獲 取磁珠0.02mL，加入封閉液0.5mL洗滌5min，至磁力架，去上清。取濃度分別為3.32、4.32和5.32logCFU/mL的菌液各1mL置于放有免疫磁珠的離心管中，再加入0.5mL TSB，混勻，置于垂直混合儀，37℃培養30min(設置不加磁珠的對照組Con.)。置于磁力架上靜置，去除上清液。加PBST(含0.1%Tween－20)1mL，洗滌 10min，置于磁力架上靜置，去除上清液。再加0.2mL PBST混勻，其中0.1mL涂布TCBS培養基，37℃培養18h計數;另0.1mL混合液用作后續的DNA提取。

1.2.5 免疫磁珠捕獲效率的檢測 對1.2.4中涂布的平板進行菌落計數，計算菌落數和捕獲率，同時以空白磁珠為陰性對照。每個實驗重復3次，結果經過P值檢測。捕獲率的計算公式如下:

捕獲率(%)=富集到的菌落數(CFU/0.1mL)/起始菌落數(CFU/0.1mL)×100

1.2.6 煮沸法進行細菌DNA的粗提 取0.1mL磁珠菌液復合物轉移至1.5mL的離心管中，于10000×g離心5min，除去上清液，加50μL NaOH(25mmol/L)，混合，95℃ 加熱 5min。加入 4μL Tris－HCl buffer(1mol/L，pH7.5)緩沖液，4℃，20000 ×g離心 5min，取上清液作為LAMP反應的模板DNA。

1.2.7 LAMP檢測 檢測方法參考文獻［17］。

2 結果與分析

2.1 免疫磁珠的制備

如圖1所示，采用Bradford法定量檢測免疫磁珠表面的抗體偶聯量，根據標準溶液BSA的蛋白量和吸光度關系，繪制標準曲線:y=0.0195x+0.0153(R2=0.9837;x為蛋白量;y為吸光度值)，將磁珠偶聯抗體后上清液的吸光度值代入公式，得到偶聯后上清液中蛋白含量，利用公式:

偶聯率(%)=(原抗體用量(μg)－偶聯上清液的抗體量(μg))/原抗體用量(μg)×100

計算可得羧基免疫磁珠(IMB－C1和IMB－C2)和甲苯磺酰胺基免疫磁珠(IMB－T1、IMB－T2和IMB－T3)的抗體偶聯量(如表1所示)。

表1 免疫磁珠的特征參數Table 1 The information of IMBs

圖1 BSA標準曲線Fig.1 The standard curve of BSA

由表1可知，不同化學偶聯鍵的免疫磁珠偶聯抗體率差異顯著;其中，IMB－C2和IMB－T2均具有100%的抗體結合率，且采用間接法制備的IMB－T3抗體結合率也相對較高。將磁珠近似看作球型來計算其單位表面積偶聯抗體量，可以得到單位表面積的抗體濃度。羧基磁珠具有較高的表面抗體濃度，分別為 34.25fg/μm2和 36.73fg/μm2，而甲苯磺酰胺基磁珠均比羧基磁珠的表面抗體濃度低了一個數量級。這表明，與甲苯磺酰胺磁珠相比較，羧基連接的免疫磁珠與副溶血性弧菌菌體細胞接觸機會更多。

2.2 免疫磁珠捕獲效率的檢測

不同稀釋度的菌液與免疫磁珠反應后，將磁珠和菌體細胞復合物涂布TCBS平板，進行菌落計數，檢測捕獲量，并計算捕獲率，空白磁珠為陰性對照。經過p值檢測(p＜0.05)，起始菌量為4.32logCFU/mL時，各個磁珠的捕獲能力差異顯著，可以用來評價磁珠類型對捕獲率的影響。表2中數據表明，針對副溶血性弧菌的檢測，羧基磁珠的捕獲能力強，分別為79%和94%，明顯優于甲苯磺酰胺基磁珠。同時，比較三個甲苯磺酰胺基磁珠，采用二抗包被的甲苯磺酰胺基磁珠IMB－T3與未包被二抗的IMB－T1和IMB－T2相比并沒有明顯的提高，表明采用直接法或者間接法制備免疫磁珠不會對捕獲能力造成影響?？v向比較發現:IMB－C2的捕獲率高于 IMB－C1，同時IMB－T2和IMB－T3的捕獲率高于IMB－T1。結果表明，無論是羧基偶聯還是甲苯磺酰胺基偶聯，自制多抗與磁珠的結合能力明顯優于后者。

2.3 LAMP檢測

在起始菌液濃度分別為4.32 logCFU/mL和3.32 logCFU/mL時，免疫磁珠和菌體細胞復合物的LAMP反應電泳結果如圖2所示，從第1泳道到第10泳道均出現亮暗程度不同的梯狀條帶，LAMP反應檢測到副溶血性弧菌的存在(陽性對照為副溶血性弧菌標準菌株ATCC33846，陰性對照為金黃色葡萄球菌)。這表明采用免疫磁珠和副溶血性弧菌菌體細胞復合物進行后續的LAMP檢測，核酸擴增過程未受到抑制性影響。

表2 不同免疫磁珠對副溶血性弧菌ATCC33846的捕獲率檢測Table 2 Enumeration of V.parahaemolyticus by different IMBs

3 討論

影響免疫磁珠富集捕獲目的菌的能力有多方面因素:抗體本身性能的優劣，抗體活性的強弱;磁珠的分散性和吸附性，這與磁珠的制備材料和方法相關;磁珠包被的化學基團，磁珠粒徑的大小，這與磁珠和抗體連接的能力相關［18］。

圖2 羧基和甲苯磺酰基偶聯免疫磁珠和副溶血性弧菌復合物的LAMP反應電泳結果Fig.2 The LAMP results of IMBs and Vibrio parahamolyticus cells complex

本研究中，抗體采用兩種方式制備完成，在自制多抗的效價略高于公司購置的多抗的情況下，無論是羧基偶聯還是甲苯磺酰胺基偶聯，自制多抗與磁珠的結合能力明顯優于后者;羧基磁珠的制備材料磁核為四氧化三鐵，殼層為氧化硅，實驗中分散性較差，吸附性好，甲苯磺酰胺基磁珠的制備材料為三氧化二鐵和四氧化三鐵，分散性好，吸附性較差;副溶血性弧菌的細胞長度在0.3×2μm，本文所用免疫磁珠的粒徑為1.2μm和2.8μm，磁珠的大小能夠確保菌體細胞與其能發生碰撞的幾率，從而降低了對捕獲率的影響。而磁珠包被的化學基團直接關系到了與抗體的結合能力，成為影響免疫磁珠捕獲能力的最主要因素。綜合考慮磁珠粒徑和濃度的不同，調整磁珠的終濃度，使單位表面積在同一數量級上，采用單位表面抗體濃度作為評價指標來衡量免疫磁珠與菌體細胞結合能力的優劣，經過實驗證明，切實可行。經過p值檢測(p＜0.05)，在起始菌液濃度為4.32logCFU/mL時，免疫磁珠捕獲率差異顯著，羧基磁珠具有明顯的優勢，IMB－C2最高為94%，其次為IMB－C1，而這兩者的磁珠單位表面抗體濃度分別為36.73fg/μm2和 34.25fg/μm2，均明顯高于甲苯磺酰胺基磁珠。將二抗包被于甲苯磺酰胺基磁珠上，是基于甲苯磺酰胺基可以結合任意蛋白，沒有選擇性，先包被二抗可以保證其與多抗連接時的特異性，但是從捕獲率的檢測結果來看，不論是直接法還是間接法偶聯抗體，對捕獲效率的影響并不大。

國際上，Shu－I曾采用TRF技術分析比較了羧基磁珠、甲苯磺酰胺基磁珠和鏈酶親和素磁珠捕獲E.coli O157∶H7的能力，鏈酶親和素磁珠的捕獲能力最強，其次為羧基磁珠，最后為甲苯磺酰胺基磁珠，與本文的結果基本吻合。且本研究中采用顯色培養基可以獲得捕獲到的目的菌活菌數，以便被作為IMS和諸多檢測技術結合使用的參考。本研究采用LAMP方法對IMBs的富集效果進行了檢測，以考察免疫磁珠菌體復合物是否會對后續相關的核酸檢測產生抑制性因子的作用。結果表明免疫磁珠和副溶血性弧菌菌體細胞復合物對LAMP反應并沒有抑制作用，且由于免疫磁珠的加入，同時減少了DNA提取過程中的損失率，更利于LAMP的檢測。

綜上所述，本研究比較分析了不同的免疫磁珠捕獲副溶血性弧菌菌體細胞的能力，得到羧基磁珠優于甲苯磺酰胺基磁珠，直接法和間接法偶聯方式對免疫磁珠的富集捕獲能力無影響;采用LAMP方法對免疫磁珠和副溶血性弧菌菌體細胞復合物進行檢測，收到了很好的檢測效果，希望能為副溶血性弧菌快速檢測方法的建立提供新思路。

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Preparation and application of Vibrio parahaemolyticus using immunomagnetic beads

SU Chen－xi1，SUN Xiao－hong1，*，LU Ying1，ZHAO Yong1，Vivian C H Wu2，PAN Ying－jie1
(1.College of Food Science and Technology，Shanghai Engineering Research Center of Aquatic－Product Processing ＆ Preservation，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China;2.Department of Food Science and Human Nutrition，University of Maine，Maine 04469，USA)

The objective of this study was to use Immunomagnetic beads(IMBs)to detect Vibrio parahamolyticus.IMBs were synthesized using anti－ V.parahaemolyticus polyclonal antibody(commercial antibody R1 and selfregulating antibody R2)and magnetic beads coated with activated carboxyl groups and tosylated surfaces groups(two carboxyl IMBs IMB－C1 and IMB－C2;three toslated IMBs IMB－T1，IMB－T2 and IMB－T3 which coated by the secondary antibody and polyclonal antibody).After the IMS process，one part of suspension was plated on TCBS to count the colony，the other to extract DNA with thermal cracking for Loop－mediated Isothermal Amplification(LAMP).The antibody concentration per surface area(AC/SA)was used for evaluation the properties of IMBs.The result showed that the AC/SA of the carboxyl IMBs are higher than toslated IMBs(34.25fg/μm2and 36.73fg/μm2).And the carboxyl IMBs captured more V.parahaemolyticus during the IMS process than toslated IMBs，when the pure culture concentration was about 4.32logCFU/mL(p ＜0.05).After the IMS process，approximately 79%and 94%of the cells in suspension were captured by the carboxyl beads with commercial and self－regulating antibodies.And，there were not obviously different about the capturing rate between the directed and indirected conjugation methods，compared the IMB－T3 and IMB－T2.The LAMP results showed that the molecule detection method was not influenced by the IMBs－cell complex.

Vibrio parahaemolyticus;immunomagnetic beads;loop－mediated isothermal amplification;carboxyl groups;tosylated groups

TS207.4

A

1002－0306(2012)17－0313－04

2012－02－29 *通訊聯系人

蘇晨曦(1985－)，女，在讀碩士，研究方向:食品安全。

霍英東教育基金會第十一屆高等院校優選資助課題(114035);上海市科技興農重點攻關項目(滬農科攻字2009年第6－1號);上海市教育委員會重點學科建設項目資助(J50704)。