醋艾葉飲片HPLC指紋圖譜研究暨異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定

周 倩，孫立立，于鳳蕊

(1.山東省中醫藥研究院，山東濟南250014;2.山東中醫藥大學，山東 濟南250014)

艾葉來源于菊科植物艾Artemisia argyi levl.et Vant.的干燥葉［1］，艾葉主要含有揮發油類、黃酮類、鞣質類和三萜類等化學成分，具有散寒止痛，溫經止血之功效，是婦科常用藥。雖然艾葉的野生資源較為豐富，臨床用量較大，但關于艾葉的研究報道卻為數很少。另外，有的地區以野艾A.lavandulaefolia DC.葉作艾葉入藥，但野艾葉療效遠差于艾葉［2］。2010版藥典通過測定艾葉中桉油精的含量來控制生品艾葉質量，但是桉油精的含量受產地、采集時間和儲存時間的影響較大［3，4］。課題組通過研究發現艾葉經醋炙后桉油精含量顯著降低，更無法作為醋艾葉的質量評價指標。

中藥指紋圖譜能比較全面的反映中藥中所含化學成分的種類和數量，從而反映中藥的質量［5］，目前對醋艾葉指紋圖譜的研究未見報道，尤其在現階段艾葉的有效成分絕大多數沒有明確的情況下，采用中藥指紋圖譜的方式，可以更全面反映其所含內在化學成分的種類與數量，進而控制其質量。植物黃酮在心血管、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、鎮痛以及消化系統等方面均有一定的藥理作用，艾葉黃酮是艾葉的主要活性物質，其中的異澤蘭黃素［6］(5，7 － 二羥基 －6，3'，4'－ 三甲氧基黃酮)對血小板聚集有顯著的抑制作用，是艾葉止血、抗凝血的活性成分，各產地艾葉中異澤蘭黃素含量未見報道。

為更好的控制醋艾葉質量，本文收集了10個批次醋艾葉飲片進行測定，建立了HPLC指紋圖譜，標定出14個共有特征指紋峰，可為醋艾葉的質量評價提供依據，采用指紋圖譜色譜條件，同時對活性成分異澤蘭黃素進行了含量測定，并同時測定了棕矢車菊素的含量，均可作為指標性成分控制艾葉質量。為有效區分艾葉和野艾，本研究同時收集了野艾醋炙品，與正品醋艾葉進行了指紋圖譜及異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量比較，結果，二者指紋圖譜有所不同，野艾醋炙品中異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量均顯著低于醋艾葉，可明顯區別二者，為臨床用藥的有效性提供了保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695型高效液相色譜儀，Waters 2996 DAD檢測器，1/10萬電子天平(Sartorius R200D，德國)。LC－350A超聲波中藥處理機(濟寧市中區魯超儀器廠)。

1.2 試藥 本研究收集了11批不同產地的艾葉，經山東省中醫藥研究院林慧彬研究員鑒定，樣品S－11為野艾，其余均為菊科植物艾的干燥葉。棕矢車菊素、異澤蘭黃素對照品由實驗室自制，經HPLC檢測純度大于98%。乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，甲醇、磷酸等其他試劑均為分析純。樣品產地來源見表1。將各批艾葉制備為醋艾葉飲片，方法如下:將輔料醋與適量水混勻，淋入凈艾葉飲片中拌勻，悶潤，220℃炒制28 min，取出，晾涼。100 kg艾葉用醋15 kg。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB－C18(4.6 mm ×250 mm，5 μm)色譜柱;以乙腈(B)－0.2%甲酸(A)為流動相，進行梯度洗脫，洗脫程序見表2;檢測波長330 nm;流速:1.0 mL·min－1;柱溫:25 ℃。

表1 樣品產地來源信息表

2.2 對照品溶液的制備 取棕矢車菊素、異澤蘭黃素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含棕矢車菊素、異澤蘭黃素對照品分別為40 μg、60 μg的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 取各供試品粉末0.5 g，精密稱定，精密加入80%甲醇20 mL，稱重，超聲提取1 h，放涼，再次稱重，用80%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，濾液過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 測定方法 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，依法測定。

表2 流動相梯度洗脫程序

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗 取樣品S－3醋艾葉供試品溶液連續進樣5次，記錄指紋圖譜。以異澤蘭黃素的色譜峰為參照峰，計算各特征指紋峰的相對保留時間和相對保留峰面積。結果，各共有特征指紋峰的相對保留時間的RSD值在0.01%～1.81%，相對保留峰面積在 0.66% ～2.89%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.5.2 重復性試驗 精密稱取樣品S－3粉末5份，照“2.3項下供試品溶液制備方法”制備5份供試品溶液，分別進樣并記錄指紋圖譜。結果，各共有特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別在0.01% ～0.91%、0.11% ～2.64%之間，表明本方法重現性良好，符合指紋圖譜要求。

2.5.3 穩定性試驗 將室溫下放置的樣品S－3的供試品溶液分別于0、2、4、8、12 h進樣分析，記錄指紋圖譜。結果，各共有特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值分別在0.01% ～0.90%、0.08% ～2.86% 之間，表明樣品溶液在12 h內穩定。

圖1 混合對照HPLC圖譜

圖2 醋艾葉對照指紋圖譜

2.6 指紋圖譜的建立及相似度評價

圖310 批醋艾葉HPLC圖譜(R為生成的對照圖譜)

2.6.1 醋艾葉飲片指紋圖譜共有模式的建立 運用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”對10批醋艾葉飲片的指紋圖譜進行相似度分析，以S－1號樣品色譜圖作為參照圖譜，經過多點校正、自動匹配，以中位數法，生成對照圖譜R，由匹配數據的輸出結果得到共有峰共26個，通過峰面積的比較，選取峰面積較大且穩定的圖譜共有峰，最后標定了14個共有特征指紋峰，結果見圖2。

參比峰的選擇:異澤蘭黃素的色譜峰(13號色譜峰)在各批次樣品圖譜中分離良好，峰面積較大且為所有樣品共有，所以確定其為參照峰。

以異澤蘭黃素保留時間和峰面積為參照，對10批樣品中14個特征指紋峰的相對保留時間和相對峰面積進行統計分析，結果分別見表3、表4。

2.6.2 相似度評價 使用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004A版”，對10批醋艾葉指紋圖譜進行相似度分析，結果，10批次醋艾葉飲片與相應對照圖譜的相似度在0.979～0.997 之間，均大于0.90，符合要求，結果見表5。

表3 10批醋艾葉共有特征峰相對保留時間

表4 十批醋艾葉共有特征峰相對峰面積

表5 與共有模式比較的醋艾葉相似度

2.7 醋艾葉、野艾醋炙品HPLC圖譜比較 取野艾醋炙品，照2.3項下方法制備供試品溶液，照HPLC指紋圖譜條件進行測定，將采集圖譜與醋艾葉對照圖譜比較，分析二者差別，主要色譜峰峰面積比較，結果見圖4和表6。

將野艾葉醋炙品HPLC圖譜與生成的對照圖譜R比較發現，野艾醋炙品HPLC圖譜與對照圖譜存在較大差異，野艾葉中37.354和41.941 min色譜峰峰面積明顯小于正品醋艾葉，46.571 min色譜峰在野艾醋炙品中未檢出，野艾醋炙品較正品醋艾葉多出A色譜峰。結果見圖4。將野艾葉與對照圖譜R峰面積比較，野艾葉醋炙品極性較大的成分較多，極性小的成分峰面積明顯小于正品醋艾葉。

圖4 醋艾葉對照圖譜R與野艾醋炙品HPLC圖譜比較(上為醋艾葉，下為野艾醋炙品)

表6 正品醋艾葉與野艾醋炙品比較結果

2.8 異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定 采用HPLC指紋圖譜條件，以外標一點法測定不同產地醋艾葉中異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量，結果見表7。

表7 不同批次醋艾葉異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定結果

由上表可見，10批醋艾葉之間含量存在一定差異，異澤蘭黃素含量在0.10% ～0.17%，棕矢車菊素含量在0.10%～0.22%，道地產區安徽及艾葉的主要產區三個產地的含量均較高。野艾葉醋炙品中異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量分別為0.04%、0.07%，明顯低于各批次醋艾葉。

3 討論

建立中藥指紋圖譜，色譜條件的優化是關鍵。本研究通過色譜條件優選，結果選擇乙腈－0.2%甲酸作為流動相，各峰的保留時間適中，分離度較好，且基線穩定，有利于指紋圖譜的分析，因此采用乙腈－0.2%甲酸水作為流動相系統;實驗中比較了室溫(25℃)、30℃下的分離效果，結果表明柱溫對分離效果影響不大，因此柱溫選擇為室溫(25℃);通過比較210、230、254、280 和 330 nm 波長下的液相色譜圖，發現330 nm條件下色譜峰面積較大，色譜峰分離度最好，色譜圖基線噪音較低，因此選擇330 nm為檢測波長。

采用研究確定的指紋圖譜色譜條件對10批不同產地醋艾葉進行了指紋圖譜分析，將艾葉指紋圖譜評價標準暫定為14個特征峰。通過測定，市售醋艾葉與生成的對照圖譜比較相似度良好，均大于0.90。不同產地醋艾葉指紋圖譜在相對保留時間上具有較高相似性，但在相對峰面積上又不完全一致，可能是由于生品艾葉生長環境不同，導致其醋炙品的質量存在差異。采用HPLC色譜條件測定了10批醋艾葉中異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量，結果異澤蘭黃素含量在0.10% ～0.17%，棕矢車菊素含量在0.10% ～0.22%，可作為指標成分控制醋艾葉質量。

通過野艾葉醋炙品HPLC圖譜與生成的醋艾葉對照圖譜R比較，野艾葉中色譜峰A為野艾特有色譜峰，14號色譜峰為10批艾葉共有峰，但野艾沒有。異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量測定結果可見，野艾葉醋炙品中異澤蘭黃素和棕矢車菊素含量明顯低于各產地的醋艾葉，這些特征均可用于區別艾葉與野艾葉。

本研究首次建立了醋艾葉HPLC指紋圖譜及異澤蘭黃素和棕矢車菊素的含量測定方法，得到的色譜圖主要色譜峰分離度較好，基線平穩，可為醋艾葉的全面質量控制研究提供參考。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010年版(一部)［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010:83.

［2］陳宗良，張慧芳.艾葉，野艾及細艾葉的比較鑒別［J］.中藥材，1999，22(5):235 －237.

［3］靳然，于密密，趙百孝，等.不同年份蘄艾葉及不同比例艾絨化學成分研究［J］.中國針灸，2010，30(5):389 －392.

［4］梅全喜，高玉橋.艾葉化學及藥理研究進展［J］.中成藥，2006，28(7):1030 －1032.

［5］陳根順，徐麗芳，李鵬.草珊瑚的HPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2011，42(2):293 －295.

［6］梅全喜.艾葉的藥理作用研究概況［J］.中草藥，1996，27(5):311－314.