DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進展

張曉峰，劉福艷

(1.山東大學(xué)管理學(xué)院，山東濟南250100;2.山東省食品藥品檢驗所，山東 濟南250101)

1985年，英國科學(xué)家杰佛雷斯(Jeffreys)利用人類微小衛(wèi)星區(qū)的DNA進行了生物個體與種屬的鑒別，并首次把這一技術(shù)稱之為DNA指紋(DNA fingerprinting)圖譜技術(shù)［1］。眾所周知，絕大多數(shù)的中藥材都是植物體、動物體和菌物體，而一切生命體都可以從基因水平或者說DNA水平上進行刻劃，因此，DNA分子水平上的指紋最能從本質(zhì)上表征中藥材自身特征。DNA指紋圖譜技術(shù)是一種在分子水平上、以藥材基因型特征為鑒定指標的新技術(shù)，它直接分析遺傳物質(zhì)DNA本身，是分析生物的基因型而非表現(xiàn)型，排除了環(huán)境因素給藥材鑒定帶來的干擾，也不受樣品形態(tài)(藥材原植物、飲片或粉末)和材料來源的影響，比傳統(tǒng)的方法(性狀、顯微、理化鑒定)更準確可靠，它不僅能區(qū)分相近物種(同科、同屬不同種)，而且可以檢測外形極為相似的同種不同變種、變型、品系、化學(xué)型乃至個體之間的DNA的細微變異。這一技術(shù)近年來正越來越廣泛地被應(yīng)用于中藥研究中［2］。本文結(jié)合有關(guān)文獻，綜述了DNA指紋圖譜的概念、原理、發(fā)展歷程及近年來在中藥質(zhì)量研究領(lǐng)域的應(yīng)用進展情況，為相關(guān)研究提供參考。

1 DNA指紋圖譜的概念與原理

DNA指紋圖譜技術(shù)是將個體的染色體DNA用限制性內(nèi)切酶消化，分離得到不同大小的DNA片段，再以重復(fù)序列中的共有序列作為核酸探針進行雜交，對所得到不同生物個體相似DNA片段的帶型圖譜(即DNA指紋圖譜，對每一個體都是獨特的)進行分析的方法。該技術(shù)能揭示并比較生物個體間關(guān)系的密切程度，有效地應(yīng)用于遺傳分析、種質(zhì)鑒定等方面。不同種生物體含有不同的DNA序列，同種生物體既有相同的DNA序列，保持同種生物體的遺傳性狀，又具有多態(tài)性，這種多態(tài)性可以是個體、種屬或變異等引起的，它使得同種生物中的各個體千差萬別，生物多樣性正是由于其基因多態(tài)性的結(jié)果。在分子水平上檢測基因多態(tài)性，比形態(tài)、組織和化學(xué)水平上檢測更能代表其變異類的遺傳標記，其鑒別結(jié)果更加準確可靠。DNA指紋技術(shù)靈敏度高，如果選擇合適的擴增引物，其結(jié)果的重復(fù)性也非常好［2］。

2 DNA指紋圖譜技術(shù)的發(fā)展歷程

DNA指紋研究始于二十世紀八十年代初期，是一種稱作限制性片段長度多態(tài)性(英文縮寫RFLP)［3］的標記技術(shù)。在細胞中有一種特殊的酶——限制性核酸內(nèi)切酶，它可以把DNA切割成長度不同的片段。這種酶有一個特點，就是它只能在DNA的特定位點上進行切割，而且，只能識別這些特異的位點。在長期的進化過程中，不同種屬的生物體中DNA上的這些限制性核酸內(nèi)切酶的切割位點是各不相同的，因此，當用一種限制性核酸內(nèi)切酶對某種生物體DNA進行切割時，就會產(chǎn)生一系列長度不同的酶切片段，形成該種生物特異的DNA指紋圖譜，這種指紋圖譜就叫做RFLP圖譜。不同種生物的RFLP圖譜是不同的，因此，根據(jù)RFLP圖譜就可以進行中藥材的品種鑒定。RFLP技術(shù)是發(fā)展最早的DNA指紋標記技術(shù)，其缺點是實驗步驟繁瑣，費時費力，應(yīng)用不便，價格昂貴。

1985年，美國科學(xué)家穆里斯(Mullis)發(fā)明了一種稱之為聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的技術(shù)［4～6］。這種技術(shù)是先人工合成一對幾個至十幾個核苷酸長的寡核苷酸引物，利用這對引物和DNA聚合酶，在有四種脫氧單核苷酸存在的條件下，就可以將要擴增的DNA片段進行指數(shù)倍地擴增，而這一切只在試管中就可以完成。

在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，1990年，威利姆斯(Williams)發(fā)明了另一種新的DNA指紋圖譜技術(shù)——隨機擴增多態(tài)性DNA(英文縮寫RAPD)技術(shù)［7］。與PCR技術(shù)中合成一對引物不同的是，在RAPD技術(shù)中，是合成一系列9－10個核苷酸長的核苷酸排列順序隨機的單鏈引物，然后，用這些引物對基因組DNA進行PCR擴增。由于不同種屬生物可擴增出的DNA片段與長度的不同，就可以形成代表這種生物自身特征的指紋圖譜，從而可以進行生物物種的鑒定。因此，RAPD技術(shù)廣泛用于中藥DNA指紋圖譜的構(gòu)建，在目前絕大多數(shù)藥用動植物DNA序列還未知的情況下，RAPD技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景。PCR技術(shù)的誕生使目的基因極易獲得，再與RFLP聯(lián)用，還產(chǎn)生了PCR－RFLP、RAPD－RFLP等方法。

20世紀90年代荷蘭科學(xué)家Pieter Vos［8］等發(fā)明、發(fā)展了高效檢測DNA多態(tài)性的新方法，稱為擴增片段長度多態(tài)性DNA(Ampli－ fied Fragment Length Polymorphism，AFLP)。AFLP是基于PCR技術(shù)擴增基因組DNA限制性片段，基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點序列，作為引物結(jié)合位點。它結(jié)合了RFLP和PCR技術(shù)特點，具有RFLP技術(shù)的可靠性和PCR技術(shù)的高效性。由于AFLP擴增可使某一品種出現(xiàn)特定的DNA譜帶，而在另一品種中可能無此譜帶產(chǎn)生，因此，這種通過引物誘導(dǎo)及DNA擴增后得到的DNA多態(tài)性可做為一種分子標記，與RFLP、RAPD比較，AFLP法構(gòu)建的DNA指紋圖譜在操作前不需要提供序列信息，而且具有效率高、重復(fù)性好、靈敏度高的優(yōu)點，其所檢測到的大多數(shù)擴增片斷與基因組的單一位置對應(yīng)，顯示了AFLP技術(shù)特別適合中藥品種鑒定的應(yīng)用價值和廣闊前景。

SSR(Simple Sequence Repeats)標記技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標記技術(shù)，也稱為微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)，是一類由幾個核苷酸(一般為1～6個)為重復(fù)單位組成的長達幾十個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列。在真核生物中，存在許多2～5 bp簡單重復(fù)序列，稱為“微衛(wèi)星DNA”，其兩端的序列高度保守，可設(shè)計雙引物進行PCR擴增，揭示其多態(tài)性。SSR具有以下一些優(yōu)點:①一般檢測到的是一個單一的多等位基因位點;②微衛(wèi)星呈共顯性遺傳，故可鑒別雜合子和純合子;③所需DNA量少。

ISSR(inter－ simple sequence repeat)是 Zietkeiwitcz［9］等于1994年發(fā)展起來的又一種微衛(wèi)星基礎(chǔ)上的分子標記。ISSR引物的開發(fā)不像SSR引物那樣需測序獲得SSR兩側(cè)的單拷貝序列，開發(fā)費用降低。與SSR標記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種特異性;與RAPD和RFLP相比，ISSR揭示的多態(tài)性較高，可獲得幾倍于RAPD的信息量，精確度幾乎可與RFLP相媲美，檢測非常方便，因而是一種非常有發(fā)展前途的分子標記。目前，ISSR標記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進化及分子生態(tài)學(xué)研究中。

3 DNA指紋圖譜在中藥研究中的應(yīng)用

近年來，中醫(yī)藥工作者將DNA指紋圖譜技術(shù)引入到自己的研究領(lǐng)域，并取得了令人矚目的成果，對中醫(yī)藥學(xué)的現(xiàn)代化進程產(chǎn)生了積極的推動作用。

3.1 名貴中藥材鑒定、道地性研究 中藥材真?zhèn)舞b別及道地品種鑒定是目前DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥研究中應(yīng)用最多的一個領(lǐng)域。隨著摻偽技巧越來越高，有時單憑傳統(tǒng)的經(jīng)驗鑒別方法已難以辨別真?zhèn)危Ｒ?guī)理化鑒別又存在著用樣量大，操作復(fù)雜，專屬性不強等缺點。DNA指紋圖譜技術(shù)以其取樣量小、減少貴重樣品損消耗、鑒定結(jié)果準確、靈敏性高等特點越來越受到人們的重視，近年來成為中藥材鑒定的重要研究手段。中藥材的質(zhì)量除了與藥材特定的生長環(huán)境和特殊的采收加工技術(shù)有關(guān)外，還與該藥材產(chǎn)區(qū)內(nèi)這一物種的地方種群或居群中遺傳上的特殊性有關(guān)，這就是藥材的“道地性”。但以前對道地藥材“道地性”的研究僅限于化學(xué)、藥理學(xué)方面。通過DNA指紋標記技術(shù)和化學(xué)、藥理學(xué)手段結(jié)合對道地藥材進行研究，并進一步對遺傳因素和環(huán)境因素在藥用植物有效成分形成中的地位及其相互作用的關(guān)系進行研究，能更好地對道地藥材、名優(yōu)藥材進行品質(zhì)評價。表1列舉了DNA指紋圖譜技術(shù)在中藥鑒定分析及道地性鑒別中的部分應(yīng)用。

表1 DNA指紋圖譜技術(shù)中藥遺傳分析及鑒定中的部分應(yīng)用實例

3.2 藥種質(zhì)資源的研究和遺傳育種 藥用植物種質(zhì)資源是一切可用于藥物開發(fā)的植物遺傳資源，是所有藥用植物物種資源的總和。種質(zhì)資源是基因的載體，植物種內(nèi)所有個體及遺傳性狀的基因構(gòu)成了該物種的種質(zhì)資源。對于遺傳多樣性水平較低的品種，應(yīng)盡可能獲得更多的變異類型，可在自然界中尋找、收集變異植株，或通過分子生物技術(shù)手段增加其自然變異率，如體細胞克隆變異、γ或UV射線致突變、原生質(zhì)體培養(yǎng)等方法。DNA指紋技術(shù)可用于藥材個體或群體的變異觀察。分析這些變異類型的遺傳分化程度及遺傳多樣性水平，對藥材的選種有重要意義［2］。通過DNA指紋技術(shù)分析藥材不同品種的遺傳關(guān)系及其差異性，在探明物種遺傳背景和親緣關(guān)系的基礎(chǔ)上，為中藥材物種資源的分析和評價及藥效學(xué)相關(guān)基因和抗病基因的定位提供重要信息，推動藥材遺傳育種的進程，同時為今后分離有價值的藥用動植物目的基因打好基礎(chǔ)，并為構(gòu)建藥用動植物基因庫提供資料。王志安［25，26］等通過采取及栽培中藥材白術(shù)樣品，采用AFLP指紋分析技術(shù)，獲得了3 003條白術(shù)的多態(tài)性擴增條帶，建立了中藥白術(shù)種質(zhì)的AFLP指紋圖譜分析體系，為我國道地藥材白術(shù)的種質(zhì)保存和育種提供證據(jù)。其他如石斛［27］、絞股藍［28］、丹參［29］、纈草［30］等藥用植物都有應(yīng)用 DNA 指紋圖譜對其種質(zhì)資源進行分析的報道，為進一步應(yīng)用DNA指紋圖譜進行資源鑒定和中藥育種學(xué)提供參考。

3.3 活性成分基因表達調(diào)控的研究 生物體內(nèi)的各種功能蛋白質(zhì)和酶都是相應(yīng)基因編碼、表達的產(chǎn)物，研究中藥材活性成分基因的差異表達對其不同特性、調(diào)控機理及基因功能的研究都有重要意義。藥用植物的生長周期是基因在一定的時空中表達的結(jié)果，伴隨著相應(yīng)的次生代謝化學(xué)成分的產(chǎn)生。DNA指紋圖譜技術(shù)對于闡明藥用植物不同生長期的分子調(diào)控機制有積極的意義，通過與cDNA等技術(shù)結(jié)合，可以達到篩選品質(zhì)基因，增加有效次生代謝產(chǎn)物合成量，提高藥材品質(zhì)的目的。

4 討論與展望

綜上所述，DNA指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)逐漸成為中藥材研究中的重要工具和手段。隨著DNA指紋技術(shù)的逐漸完善，其特異性和信息量逐漸增加，檢測的精確度越來越高，對于分子水平上鑒定中藥真?zhèn)巍⒌赖匦匝芯俊⑦z傳分析和育種以及有效成分的基因表達調(diào)控等方面的研究產(chǎn)生了劃時代的意義，具有廣闊的前景。隨著新技術(shù)的出現(xiàn)和各技術(shù)間的相互結(jié)合使用，DNA指紋圖譜技術(shù)將會在中藥研究中發(fā)揮更大作用。

［1］Jeffreys AJ，Wilson V，Thein SL.Hypervariable minisatellite regions in human DNA.Nature，1985，314(7):67.

［2］江峰.DNA指紋圖譜技術(shù)及其在中藥研究中的應(yīng)用［J］.海峽藥學(xué)，2005，17(4):183 －185.

［3］Lander ES，Botstein D.Mapping complex genetic traits in humans:new methods using a complete RFLP linkage map［J］.Cold Spring Harb Symp Quant Biol，1986，51:49 －62.

［4］Saiki RK，Scharf S.Faloona F，et al.Enzymatic amplification of beta－globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia［J］.Science，1985，230(4732):1350 －1354.

［5］Mullis K，F(xiàn)aloona F，Scharf S，et al.Specific enzymatic amplification of DNA in vitro:the polymerase chain reaction［J］.Cold Spring Harbr Symp in Quant Biol，1986，51(1):263－273.

［6］Mullis KB，F(xiàn)aloona FA.Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase － catalyzed chain reaction［J］.Methods Enzymol，1987，155:335 －350.

［7］Williams JG，Kubelik AR，Livak KJ，et al.DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］.Nucleic Acids Res，1990，18(22):6531 －6535.

［8］Vos P，Hogers R，Bleeker M，et al.AFLP:a new technique for DNA fingerprinting［J］.Nucl Acids Res，1995，23(21):4407－4414.

［9］Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)－anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，1994，20(2):176－183.

［10］丁建彌，萬樹文，梅其春.用隨機擴增DNA(RAPD)技術(shù)鑒定野生山參［J］.中成藥，2001，23(1):3 －5.

［11］Shaw PC，But PP.Authentication of Panax species and their adulterants by random－primed polymerase chain reaction［J］.Planta Med，1995，61(5):466 －469.

［12］曹暉，畢培曦，邵鵬柱.中藥材蒲公英及其混淆品的DNA 指紋鑒別研究［J］.Journal of Chinese Pharmaceutical Sciences，1996，5(4):186 －194.

［13］王義權(quán)，周開亞，徐珞珊，等.中藥材烏梢蛇及其混淆品的DNA序列分析鑒別［J］.藥學(xué)學(xué)報，1999，34(1):67－71.

［14］李堅韌，王紅艷，康熙雄.RAPD技術(shù)對白花蛇舌草真?zhèn)舞b別的應(yīng)用［J］.中國誤診學(xué)雜志，2009，9(3):509－510.

［15］吳平，周開亞，張朝暉，等.海馬類藥材的分子遺傳標記鑒定研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，1998，33(3):67－74.

［16］崔光紅，陳敏，黃璐琦，等.藥用肉蓯蓉的遺傳多樣性RAPD分析［J］.中國中藥雜志，2004，29(8):727－730.

［17］邵愛娟，李欣，黃璐琦，等.不同種源黃芩的RAPD分析［J］.中國中藥雜志，2006，31(6):452 －455.

［18］羅志勇，周鋼，周肆清，等.AFLP法構(gòu)建人參、西洋參基因組 DNA 指紋圖譜［J］.藥學(xué)學(xué)報，2000，35(8):626－629.

［19］陳要臻，王嵐，馬逾英，等.川芎簡單序列重復(fù)間區(qū)多態(tài)性和擴增片段長度多態(tài)性分子標記技術(shù)多態(tài)性比較研究［J］.時珍國醫(yī)國藥，2009，20(6):1422 －1424.

［20］梁洪卉，程舟，楊曉伶，等.青海省冬蟲夏草的遺傳變異及親緣關(guān)系的形態(tài)性狀和 ISSR分析［J］.中草藥，2005，36(12):1859 －1864.

［21］左云娟，朱培林，劉強，等.道地藥材江枳殼品種遺傳學(xué)關(guān)系的ISSR證據(jù)［J］.中國中藥雜志，2005，30(18):1416－1419.

［22］沈穎，徐程，萬小鳳.ISSR－PCR在石斛種間鑒別中的應(yīng)用［J］.中草藥，2005，36(3):423 －427.

［23］徐紅，王燕燕，魏丹紅，等.不同產(chǎn)地丹參藥材的ISSR分析與鑒別［J］.中藥新藥與臨床藥理，2007，18(6):454－457.

［24］王潤玲，唐鋮，周曄，等.玉竹及其摻偽品的RAPD鑒定［J］.中草藥，2006，37(11):1727 －1729.

［25］王志安，徐行，沈曉霞，等.白術(shù)種質(zhì)AFLP指紋圖譜分析體系的建立和應(yīng)用［J］.中藥材，2008，31(4):483－487.

［26］肖碩.AFLP分子標記技術(shù)在中藥研究中的應(yīng)用進展［J］.生物技術(shù)通報，2010，5(12):69 －72.

［27］虞泓，和銳，倪念春，等.石斛屬4種植物的AFLP分析［J］.中草藥，2004，35(7):808 －810.

［28］江波.縉云山藥用植物絞股藍遺傳多樣性研究［D］.重慶:西南師范大學(xué)，2005.

［29］郝崗平，孫立彥，史仁玖，等.山東產(chǎn)丹參遺傳多樣性的擴增片段長度多態(tài)性指紋分析［J］.時珍國醫(yī)國藥，2007，18(1):51 －53.

［30］黃寶康.中國纈草屬植物的生藥學(xué)及纈草的種內(nèi)變異研究［D］.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)，2005.