一株枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化

賀永明 （遼寧農業職業技術學院 熊岳 115009）

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一株枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化

賀永明 （遼寧農業職業技術學院 熊岳 115009）

采用正交試驗對1株枯草芽孢桿菌的發酵培養基進行優化。確定了最佳的培養基配方為：葡萄糖25g/L，豆粕粉60g/L，玉米漿8g/L，在接種量為2%的情況下，發酵溫度37℃，發酵時間24h，所獲得活菌數約為5.3×109CFU/mL。

枯草芽孢桿菌 發酵培養基 優化

微生態制劑成為抗生素較為理想的替代品[1]。芽孢桿菌作為微生態制劑使用的微生物，是國際公認可在飼料中直接使用的微生物菌種[2]。由于其具有耐酸、耐高溫和耐高壓，是一類好氧微生物，通過生物奪氧，降低氧化還原電勢，有利于厭氧微生物的生長，從而保持腸道微生態系統平衡，而且，芽孢桿菌在腸道中能產生多種消化酶和有機酸，提高飼料的利用率，抑制有害菌的繁殖、保證宿主健康[2-4]。因而其研究和應用受到廣泛重視。

芽孢桿菌的發酵培養是工業化大規模生產芽孢桿菌制劑的前提。發酵培養基配方是影響微生物發酵的重要因素之一[4-6]。本文以一株枯草芽孢桿菌為研究對象，通過對其搖瓶發酵培養基進行優化，其結果為芽孢桿菌制劑的工業化生產提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，購買于中國科學院微生物研究所，菌種編號8306。

1.1.2 儀器 恒溫振蕩器搖床、pH-211酸度計、高壓蒸汽滅菌鍋、高速萬能粉碎機、無菌超凈臺、電子天平。

表1 正交試驗因素水平

1.1.3 培養基 種子培養基：牛肉膏3g，大豆蛋白胨10g，NaCl 5g，定容至1000ml，pH7.0，0.1MPa滅菌20min。發酵培養基：本試驗以葡萄糖、豆餅粉、玉米漿作為碳源和氮源，選用3因素3水平按正交設計表L9(33)安排試驗(表1)。500ml搖瓶裝液量100ml，pH值7.0，0.1MPa滅菌20min。每種培養基3個重復，共27個培養基。試驗結果為3次重復試驗的平均值。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 將枯草芽孢桿菌從保存的斜面轉接于新鮮試管斜面，于37℃培養24h。

1.2.2 種子液的制備 取培養好的斜面菌種再接種于盛有100ml無菌種子培養基的250ml三角瓶中，置搖床37℃振蕩培養18h，轉速為160r/min。

1.2.3 藥瓶培養 分別取2mL種子液，接入盛有100mL無菌液體培養基的500mL三角瓶中(接種量為2%V/V)。置搖床中，37℃震蕩培養24h，轉速為160r/min，培養結束后測定活菌數(CFU/ml)。每個培養基做3個重復。

1.2.4 活菌計數的測定 采用傾注倒平板法：采用無菌水作一系列稀釋，每一稀釋度作3個平皿，37℃培養24h，進行菌落計數。

1.2.5 數據處理 采用SPSS10.0對正交試驗結果進行方差分析[7]。

2 結果與分析

由表3的方差結果可知，3因素對枯草芽孢桿菌發酵影響的顯著性依次為：葡萄糖>玉米漿>豆餅粉，即葡萄糖對菌體的增殖的影響顯著(P<0.05)，玉米漿次之，豆餅粉影響最小(P>0.05)。

表2 發酵培養基優化正交試驗結果

表3 正交試驗方差分析

注：F0.1(2,2)=9.0

以培養基結束時的活菌數(CFU/mL)作為考察指標，從表2可知，試驗條件下優化水平的最佳的組合是A3B2C3，即葡萄糖濃度是25g/L，豆餅粉濃度為60g/L，玉米漿濃度是8g/L。在接種量為2%的情況下，當采用此種配比的發酵培養基37℃培養24h后，活菌數目可達5.3×109CFU/ml。

3 討論

本試驗研究了營養條件對枯草芽孢桿菌菌數的影響。在不同營養條件的研究中，證明了該菌株的生長較適應速效碳源葡萄糖，但長效氮源豆餅粉對該菌株的生長影響較少。秦艷等[4]在枯草芽孢桿菌發酵條件的優化研究中，證明葡萄糖和酵母浸出物對菌數的提高作用顯著。劉輝等[8]在一株枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化中發現，豆粕液是影響芽孢桿菌菌數生長的較為顯著的因素。本試驗出現不同的結論可能芽孢桿菌能很好地利用酵母浸出物，與酵母浸出物富含氨基酸、維生素和未知生長因子有關；另外，不同的菌株，不同的營養配方，在一定范圍內也會影響菌數的生長。玉米漿中富含氨基酸、生物素、維生素和微量元素等，是微生物生長或代謝產物合成的促進劑，也會影響到芽孢桿菌菌數的生長，這與谷春濤等[6]的研究一致。

微生態制劑的推廣及其使用效果，一定程度上因成本過高和產品的質量而受到影響。因此，在微生態菌株的發酵培養中，降低培養基的成產成本，提高單位體積培養液中的菌體數目至關重要。本文僅對枯草芽孢桿菌發酵培養的條件進行了初步研究，該結果對枯草芽孢桿菌在發酵罐的生產工藝上提供了重要的參考數據，對后續的工業發酵有重要意義。

[1] 朱馨蕾. 動物微生態制劑的研究進展及存在問題[J]. 山東畜牧獸醫. 2008,8: 9-11.

[2] 熊峰, 王曉霞, 余雄. 芽孢桿菌作為微生物飼料添加劑的生理功能研究進展[J]. 北京農學院學報, 2007,22(1): 76-79.

[3] 張保全, 朱年華. 芽孢桿菌在畜牧業中應用的研究進展[J]. 江西畜牧獸醫雜志, 2007,1: 2-3.

[4] 秦艷, 李衛芬, 黃秦. 枯草芽孢桿菌發酵條件的優化[J]. 飼料研究, 2007, 12: 70-74.

[5] 李超, 孫冬巖. 枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化[J]. 飼料研究, 2009, 10: 55-56.

[6] 谷春濤, 彭愛銘, 薩仁娜等. 地衣芽胞桿菌TS-01發酵培養基的優化[J]. 飼料工業, 2003,24(8): 19-20.

[7] 周德慶. 微生物學試驗教程[M]. 北京: 高等教育出版社, 2006.

[8] 劉輝, 魏祥法, 井慶川等. 一株枯草芽孢桿菌發酵培養基的優化[J]. 山東農業科學, 2007,1: 100-101.

（2012–03–03）

S852.61+6

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1007-1733(2012)05-0014-02