大腸桿菌油乳劑滅活疫苗的研制及檢測

王照軍 董麗華 宋倩倩 王明權(quán)

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大腸桿菌油乳劑滅活疫苗的研制及檢測

王照軍①董麗華②宋倩倩①王明權(quán)③

（①山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院 泰安 271017 ②山東省臨清市畜牧中心 ③山東省招遠(yuǎn)市宋家獸醫(yī)站）

本試驗(yàn)詳細(xì)闡述了大腸桿菌油乳劑滅活苗的制備過程，并對滅活苗進(jìn)行了無菌檢查，物理檢查，安全檢查和效力檢查。試驗(yàn)結(jié)果表明，該油乳劑滅活苗制作工藝合理，性質(zhì)穩(wěn)定，并能對易感動物形成有效保護(hù)，保護(hù)率達(dá)90%，在預(yù)防雞大腸肝菌病的發(fā)生中起重要作用。

大腸肝菌 油乳劑 滅活苗 檢測

大腸桿菌是引起重要畜禽疾病的病原菌之一，近年來，隨著大量高效抗菌藥物的普遍應(yīng)用，大腸桿菌的抗藥性也越來越強(qiáng)，這給防治大腸桿菌病帶來很大的困難。因此研制大腸桿菌不同血清型的油乳劑疫苗特別是自家滅活疫苗，越來越受到重視并被廣泛的采用。本試驗(yàn)對致病性大腸桿菌進(jìn)行了培養(yǎng)，研制了大腸桿菌油乳劑滅活疫苗，對油乳劑疫苗的制備、檢測作以闡述。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 大腸桿菌樣品 來自山東聊城臨清市5個肉仔雞養(yǎng)殖場的大腸桿菌病病死雞，無菌采取心、肝、脾病料，于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基劃線分離純化培養(yǎng)；并通過試管凝集試驗(yàn)確定其血清型主要為O32，O68，O78，擴(kuò)大培養(yǎng)作為大腸桿菌種液。

1.1.2 培養(yǎng)基 麥康凱瓊脂，普通肉湯，普通瓊脂等培養(yǎng)基，購自天津英博倫生化試劑有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物 家兔和健康雞，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院畜牧場提供。

1.1.4 試劑 10號醫(yī)用白油；Span-80(去水梨醇單油酸酯)或Span-85(去水梨醇三油酸酯) ，Tween-80(聚氧乙烯脫水山梨酸)；甲醛液、硬脂酸鋁。

1.1.5 儀器及設(shè)備 光學(xué)顯微鏡，溫箱，高壓滅菌鍋，組織粉碎機(jī)，離心機(jī)等由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動科院臨床系實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)液的制備 制備100ml普通肉湯培養(yǎng)基高壓滅菌15磅20min冷卻；同時制備多個100ml營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，滅菌備用。

1.2.2 增菌培養(yǎng)及細(xì)菌滅活檢驗(yàn) 在普通肉湯培養(yǎng)中接種大腸桿菌種液，每個三角燒瓶接種5ml，37℃培養(yǎng)24h后細(xì)菌計數(shù)。加0.5%的福爾馬林滅活菌液24h。

1.2.3 細(xì)菌計數(shù)(傾注培養(yǎng)法) 檢測樣品→做成8個適當(dāng)倍數(shù)稀釋→選擇最后2~3管，每個稀釋加1ml于2個平皿中→加營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(取6個平皿)→37℃，24h培養(yǎng)→計數(shù)。

1.2.4 油乳劑的配制及滅活疫苗的制備 白油佐劑配制方法：白油:Span-80:Tween-80=90:7.6:2.4混合再加總重量2%的硬脂酸鋁混合均勻，116℃高壓滅菌及為白油佐劑。本試驗(yàn)制備的油乳劑為單向性油包水型(W/O)，以10號白油為油相，以Span-80為油相乳化劑，硬脂酸鋁為穩(wěn)定劑，以Tween-80為水相乳化劑。將油相與水相按一定3:1比例混合，組織搗碎機(jī)高速10000r/min攪拌5min ，經(jīng)48h滅活制成油乳劑疫苗，抽檢、分裝備用。

1.2.5 油苗品質(zhì)檢查 （1）無菌檢驗(yàn)。取油乳劑疫苗5ml，接種于普通營養(yǎng)瓊脂及厭氧肉湯中，37℃培養(yǎng)24h，觀察有無細(xì)菌生長。（2）安全檢驗(yàn)。取健康的20日齡AA肉雞5只、家兔2只肌內(nèi)注射2ml，又取同樣數(shù)量的肉雞和家兔腹腔注射2ml，并做對照組，飼養(yǎng)15d，觀察肉雞家兔臨床表現(xiàn)。（3）效力檢驗(yàn)。取油苗肌肉注射20日齡雛雞10只，0.13ml/只，另設(shè)10只對照，25d以后，用以上致病性大腸桿菌血清型108~109個/只，腹腔注射，觀察15d。（4）物理性狀檢查油苗滴于蒸餾水表面試驗(yàn)：將疫苗滴于蒸餾水表面，觀察油苗擴(kuò)撒程度；粘度測定：用1ml直徑1.2mm吸管，室溫垂直放出0.4ml，記錄所需時間；穩(wěn)定性測定：油苗經(jīng)3000r/ min 離心15min；顆粒大小：抹片鏡檢觀察顆粒大小。

2 試驗(yàn)結(jié)果

表1 油乳劑滅火苗物理性狀檢查結(jié)果

表2 油乳劑滅火苗安全性及效力檢查結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明大腸肝菌種液增菌效果良好，數(shù)量多，符合疫苗制作要求；油乳劑滅活為油包水型無細(xì)菌，性質(zhì)穩(wěn)定，顆粒均勻(表1)。安全性和效力檢查結(jié)果表明該疫苗安全可靠(表2)。

3 討論與小結(jié)

本試驗(yàn)證明，研制的雞大腸桿菌油乳劑滅活苗物理性狀符合要求，制苗工藝合理，所選菌株可以用于油乳劑滅活苗制苗使用，并能產(chǎn)生較好的免疫應(yīng)答。

由于大腸桿菌致病性血清型較多，且不同血清型間交叉保護(hù)率低。為提高免疫效果，在制備滅活疫苗時宜從本地區(qū)或本雞場分離到的不同血清型的菌株作為制苗菌種，方能取得更好的免疫效果。滅活疫苗的保護(hù)率除與血清型有關(guān)外，還與疫苗的滅活方法、水相與油相的比例、乳化劑的選擇劑量以及乳化工藝有關(guān)。

本油乳劑油乳劑經(jīng)試驗(yàn)證明安全可靠，可以用于本地大腸桿菌病防控。但由于條件有限，本試驗(yàn)在進(jìn)行在安全性和效力檢驗(yàn)時，所用試驗(yàn)動物數(shù)量偏少，今后應(yīng)擴(kuò)大試驗(yàn)動物數(shù)量，保證疫苗安全性。

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（2012–02–23）

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