酒花中原花青素的提取純化研究

單 巖，李永仙，鄭飛云，劉春鳳，李 崎，*

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122; 2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122)

酒花中原花青素的提取純化研究

單 巖1，2，李永仙1，2，鄭飛云1，2，劉春鳳1，2，李 崎1，2，*

(1.江南大學工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫 214122; 2.江南大學生物工程學院，江蘇無錫 214122)

建立了酒花中原花青素的初步提取方法。以乙醇為萃取劑的有機溶劑萃取最佳條件為:pH為4.0～4.2，萃取劑乙醇濃度為50%，萃取溫度85℃(沸騰)，萃取時間2h，料液比為1∶20。得到酒花中原花青素粗提液，用大孔吸附樹脂(φ10×200mm)為填料的層析柱進一步分離提純。從國產ADS－8、ADS－17、ADS－21、AB－8和D101五種不同大孔吸附樹脂中選擇分離效果最好的AB－8樹脂，進行原花青素粗提液的層析柱動態吸附實驗，得到最佳大孔樹脂吸附分離條件為:柱體積為14.5mL，酒花粗提液原花青素濃度為1.8mg/mL時，上樣量為3mL，上樣流速為20mL/h，洗脫劑乙醇濃度為100%，洗脫流速為60mL/h，洗脫劑用量為70mL。

酒花，原花青素，提取，純化

啤酒中的原花青素(Procyanidins，PC)主要來自于原料麥芽和酒花中，他們能夠影響啤酒的特性，包括風味、收斂性、混濁、酒體及豐滿度［1］。在啤酒中，低聚原花青素一方面作為抗氧化劑，保護一些較敏感的組分［2］，且能在較大程度上防止原料在整個過程中的氧化降解，保持原料新鮮度，并延長成品啤酒的貨架期;另一方面，某些低聚原花青素易發生氧化、聚合等反應，使原料和啤酒產生老化變質，造成啤酒膠體性質不穩定，影響啤酒的非生物穩定性，縮短啤酒保質期。已經有向酒中添加花青素的研究表明釀造過程中從酒花進入酒體的花青系和提取純化的花青素量相差較大。本工作通過對原料酒花中原花青素提取條件的研究，確定了最佳提取條件，為進一步研究打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗用酒花多酚酒花顆粒 捷克波西米亞，札一香花和青島大花為玉門拓璞酒花公司;(+)－兒茶素標準品 美國Sigma公司;AB－8、ADS－17、ADS－8、ADS－21、D101大孔吸附樹脂 均購自天津南開合成有限公司;甲醇 色譜純;丙酮、乙酸乙酯、無水乙醇等試劑 為分析純;實驗用水 均為去離子水，使用前經0.45μm無機膜過濾。

HB－10旋轉蒸發儀 德國IKA公司;Laboport真空抽濾機 德國KNF公司;KQ3200DB型數控超聲儀 昆山超聲儀器公司;AL204電子天平 Mettler Toledo公司;離心機 德國Eppendorf公司;玻璃層析柱(φ10×200mm) 上海生工。

1.2 濃鹽酸－香草醛法測定原花青素

1.2.1 香草醛溶液的配制 精確稱取一定量香草醛，以50%甲醇溶液溶解并定容，配制成40g/L香草醛溶液。

1.2.2 濃鹽酸－香草醛法 取待測液1m L，依次加入香草醛－甲醇溶液3m L，濃鹽酸1.5m L，混勻后于20℃水浴15min，500nm處測吸光度［3］，以1m L甲醇代替待測液作為空白對照。整個操作過程應避光進行。

1.2.3 兒茶素標準曲線的繪制 精確稱取兒茶素標準樣品配制1.0mg/m L標準溶液，分別取0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0m L，定容10m L，以香草醛－濃鹽酸法測吸光度［4］，繪制兒茶素標準曲線。

1.3 酒花中原花青素有機萃取條件的確定

Zhao H［5］研究表明疏水性溶劑對多酚的萃取不是很有效率，但是乙酸乙酯或2－丁酮依然在多酚提取中有很大作用［2，6］。原花青素可能在甲醇中會解聚合［7］，因而實驗選用乙醇為萃取劑。許多多酚在pH高于6條件下經常會發生降解(自氧化)產物為A型二聚物(兩個黃烷－3－醇聚合，其中有一個C4－C8的單鍵和一個C2和O－C7醚鍵)。原花青素低聚體在pH低于4的情況下會解聚合(如原花青素B2會產生表兒茶素和B5異構體)［8］，在pH低于4時會發生酶促氧化反應產生黃烷間C－O連接的二聚體［9］。因而，在實驗中，保持浸提液pH在4.0～4.2之間。分別精確稱取2g酒花于干燥離心管中，按浸提溫度、浸提液乙醇濃度、料液比、最佳浸提時間分別按下述條件優化后，8000 r/m in離心10m in，過濾后稀釋十倍，采用香草醛－鹽酸法測吸光度。

浸提溫度:分別加20m L體積分數70%乙醇，保鮮膜密封，分別置于25、40、55、70、85℃水浴1h。

浸提液乙醇濃度:向每份酒花中加入20m L濃度分別為30%、50%、70%、90%、100%的乙醇提取，保鮮膜密封，85℃水浴1h。

料液比:采用料液比分別為1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g∶m L)，保鮮膜密封，85℃水浴1h，乙醇濃度為上一步確定的最佳濃度。

最佳浸提時間:以已確定的提取條件加入提取液，保鮮膜密封，85℃水浴1h，浸提時間分別為0.5、1、2、3、4h。

1.4 大孔吸附樹脂的選擇

1.4.1 大孔吸附樹脂的預處理 D101處理方法如下:a.于層析柱內加入相當于裝填樹脂體積0.4～0.5倍的丙酮，將新的D101樹脂投入柱中，使其頁面高于樹脂層約3cm，浸泡24h。b.用兩倍柱體積的丙酮，以2BV/h的流速通過樹脂層后浸泡4～5h。c.用乙醇以2BV/h的流速通過樹脂層，洗至流出液加水不顯白色渾濁為止，并以同樣的流速洗干凈乙醇。d.用2BV的5%鹽酸溶液，以4～6BV/h的流速過樹脂柱，并浸泡2～4h，而后用水洗至出水的pH為中性。e.用2BV的2%氫氧化鈉溶液，以4～6BV/h的流速過樹脂柱，并浸泡2～4h，后用去離子水洗至出水的pH為中性。

本研究中使用的ADS－8、ADS－17、ADS－21和AB－8均為新樹脂，只需乙醇浸泡24h后以去離子水洗至無味即可。

1.4.2 大孔吸附樹脂的選擇 取經預處理的樹脂，采用濕法裝柱，填充體積14.5m L，去離子水500m L/h洗柱約10m in，使柱裝實，將用最佳提取條件所提取的濃度為1.8mg/m L的酒花原花青素粗提液的上層析柱，上樣結束后調至最大流速(1000m L/h)用去離子水沖洗柱子，沖出雜質，用水體積約150m L，一定流速一定濃度的乙醇洗柱，收集洗脫液，洗脫劑約120m L，旋轉蒸發儀蒸出乙醇，稀釋至所需體積，香草醛－鹽酸法測原花青素濃度。

1.5 動態吸附實驗

1.5.1 最佳上樣量的確定 以不同量的原花青素粗提液上層析柱，上樣流速梯度為20m L/h，每10min收集洗脫液旋蒸定容后，測吸光度，繪制大孔吸附樹脂對酒花原花青素提取物的穿透曲線。

1.5.2 上樣流速、洗脫流速、洗脫劑濃度的確定 對已選擇大孔樹脂進行動態吸附實驗，按下述條件所得洗脫液蒸出乙醇定容至相同體積香草醛－濃鹽酸法測原花青素濃度。上樣流速:洗脫流速60m L/h，上樣流速梯度為10、20、40、60、100m L/h。洗脫流速:上樣流速20m L/h，洗脫流速梯度為40、60、80、120、160m L/h。洗脫劑濃度:以一定量的酒花中原花青素的粗提物上層析柱，洗脫流速60m L/h，上樣流速梯度為20m L/h，洗脫劑乙醇濃度分別為50%、70%、80%、90%、100%。

1.5.3 原花青素回收率及洗脫回收率計算公式

洗脫回收率(%)=乙醇洗脫液中原花青素總量×100/(樣品中原花青素總量－水洗液中原花青素總量)

2 結果與討論

2.1 兒茶素標準曲線的繪制

以不同濃度的兒茶素標準品繪制兒茶素標準曲線如圖1所示，兒茶素濃度范圍在0～0.10mg/m L時，在500nm下測得的吸光度值有很好的線性關系，所得方程為y=1.9330X－0.0014(R2=0.9995，n=8)，因此在測定原花青素濃度時，將待測樣品稀釋到一定濃度，用此方法在相同條件下測得的吸光度在兒茶素標準曲線所示吸光度范圍內，即可用兒茶素含量來表示待測樣品中原花青素含量。

圖1 (+)－兒茶素標準曲線Fig.1 Standard curve of(+)－catechin

2.2 酒花中原花青素有機萃取條件的確定

一般來說，溫度越高，擴散速度越快。從圖2－a可以看出在萃取劑乙醇沸騰前萃取效果在55℃達到最好，此時原花青素含量最高。隨溫度升高提取率略有下降，當溫度達到85℃時，萃取劑沸騰，得到的萃取效果大大好于前面的效果，推測當溶劑沸騰后，大大加速了細胞破碎，促進有效成分迅速溶出，且沸騰導致溶劑中溶氧量急劇減少，從而減少原花青素的氧化，同時也說明萃取劑沸騰前有效組分不能最大限度溶出。但是，由于溶劑為乙醇，其沸騰后揮發嚴重，因而在提取過程中應盡量將浸提器皿密封，在減少浸提溶劑損失的同時也能減少原花青素的氧化變性。

原花青素含有酚羥基，具有一定的極性，提取過程中乙醇濃度會影響提取溶劑的極性，進而影響對原花青素的溶解性及選擇性［10］，因而只有在合適的乙醇濃度下原花青素的得率才會較高。乙醇濃度對原花青素提取效果的影響如圖2－b所示。實驗過程中發現30%乙醇的提取液比較難過濾，而且濾液較混濁，而90%和100%乙醇在85℃浸提過程中沸騰嚴重，揮發嚴重。另外多酚類化合物很容易與蛋白、多糖形成復合物，會在以后的操作中造成沉淀損失，因而要選擇合適的乙醇濃度同時也要盡量減少蛋白含量。綜合考慮，在乙醇濃度為50%和70%時原花青素提取率相差不太大，其50%乙醇濃度適中且提取效果最好。

濃度差是溶劑提取過程的一個推動力。在提取過程中，保持良好的濃度差，將得到好的浸提效果。一般說來，用的溶劑越多，能被浸取出來的物質就越多，原花青素的溶解是溶質的溶劑化過程［11］。當擴散達到平衡時，再增加溶劑量也不會使浸出物質有所增加。同時，提取溶劑用量的增大，對后面的過濾、濃縮以及提取溶劑的回收會造成較大的負面影響。由圖2－c結果顯示，當料液比達1∶20以后，提取效果相差不大，而料液比的提高會給后續處理帶來麻煩，且過高的料液比極大地造成浸提液的浪費，因而1∶20為最適合的料液比。

浸提的時間過短，與蛋白質、纖維素結合的酚類物質來不及溶出，浸提時間過長則由于多酚類物質穩定性不好，容易發生氧化聚合等反應，因而浸提時間對于原花青素提取有較大影響。圖2－d顯示浸提時間為0.5h和2.0h時提取效果比較好，重復幾次結果都是如此，初步推測在0.5～1h這段時間已經萃取出的原花青素發生了反吸附。1.0h后數據顯示一個先升后降的趨勢，與理論相同，故認為浸取時間為2h比較好。

綜上所述，采用乙醇作為萃取劑萃取薩茲多酚顆粒中原花青素的最佳條件為:萃取劑體積分數50%乙醇，萃取溫度為乙醇沸騰(85℃)，料液比1∶20，萃取時間為2h。

2.3 大孔吸附樹脂的選擇

選擇五種國產大孔吸附樹脂，AB－8，ADS－17，ADS－8，ADS－21，D101，利用動態吸附實驗，得到洗脫液，旋轉蒸發除乙醇稀釋至相同體積，以濃鹽酸－香草醛法測原花青素濃度。得到經5種不同樹脂后原花青素含量情況，如表1所示。

由結果不難看出，從原花青素總量來看，AB－8，ADS－8，D101三種樹脂效果比較好。但考慮到D101樹脂處理比較困難，且根據報道，AB－8大孔樹脂對于低聚原花青素的吸附能力更好，因而選取AB－8大孔樹脂為吸附樹脂作為實驗用樹脂。

圖2 不同萃取條件對原花青素提取的影響Fig.2 Effect of different extraction conditions in proanthocyanidins extract

表1 不同樹脂處理后原花青素吸光度Table 1 Absorbance of procyanidins after different resins treatment

2.4 AB－8樹脂提取原花青素的動態吸附實驗

以AB－8樹脂為層析柱填料進行動態吸附實驗。將經過有機溶劑萃取的酒花原花青素粗提液，旋轉蒸發濃縮，濃縮液濃度為1.8mg/m L，以此濃縮液作為動態吸附實驗樣品，進行動態吸附條件的選擇。

2.4.1 最佳上樣量的確定 上樣流速為20mL/h，利用AB－8大孔吸附樹脂對酒花原花青素進行提取物，不同的上樣體積對原花青素提取的影響如圖3所示。

隨著上樣量的增加，流出液中原花青素的濃度也隨之提高，由于剛開始上樣時，樹脂中填充的水被率先洗下來，導致第一個洗出樣中不是吸附后的洗脫下來的原花青素，因而含量特別低;隨著上樣量提高，到第二個樣品時樣品已完全是吸附后的液體，上樣量2～3m L時，洗出液體濃度保持相同，說明此時吸附處在一個平衡的過程，當上樣量高于3m L后，洗出液原花青素濃度迅速提高，說明柱體已超過吸附平衡，不能最大量吸附原花青素，吸附率降到80%以下，因而可以認為上樣量為3m L最好。

圖3 上樣量對原花青素提取的影響Fig.3 Effect of sample volume in procyanidins extract

2.4.2 上樣流速、洗脫流速、洗脫劑濃度的確定 對AB－8樹脂進行動態吸附實驗，采用1.5.2方法測得的原花青素動態吸附實驗結果如圖4所示。

圖4 動態吸附條件對原花青素提取的影響Fig.4 Effect of different conditions of dynamic adsorption in procyanidins extract

由圖4－a可知，當原花青素上樣流速為20m L/h和100m l/h時效果最好，但是在實驗過程中發現，以100m L/h流速上樣時，樹脂吸附效果不完全，所得洗脫液有渾濁現象，推測由于流速增加導致一些非原花青素物質與樹脂間范德華力發生變化而被吸附［12］，而以20m L/h上樣所得洗脫液較清亮，雜質少，因而選最佳上樣流速為20m L/h。

洗脫流速對提取效率至關重要。洗脫流速過快，洗脫劑來不及與被吸附的多酚類物質充分作用，使得從大孔樹脂吸附位點上置換出的多酚物質量減少，而洗脫速度過慢，目標物質不能由樹脂柱中洗脫下來，達不到層析目的，因而選擇的洗脫流速必須適中［13］。由圖4－b可知，洗脫流速為60mL/h時，不僅得到的原花青素含量最高，且流速適中又不造成時間浪費。

在洗脫劑濃度實驗中，當洗脫劑濃度為100%時，洗脫效果最好(如圖4－c)，且洗脫劑用量最少，洗脫劑用量越少，后續的處理就會變得越簡單，同時后續處理的損失就越少。

采用AB－8樹脂裝柱，柱體積為14.5m L，上樣濃度1.8mg/m L，上樣量3m L，上樣流速20m L/h，用100%乙醇洗脫，洗脫流速為60m L/h，每得洗脫液10m L洗脫液測一次洗脫液中原花青素濃度。則用100%乙醇，以60m L/h洗脫速度對AB－8樹脂進行解吸附，解吸附曲線如圖5所示。

圖5 AB－8樹脂解吸附曲線Fig.5 Desorption curve of AB－8 resin

洗脫劑用量過少，洗脫不完全;洗脫劑用量過多，使后續操作不便的同時也增加了實際生產成本，因此洗脫劑用量的選擇也很重要。由圖5看出，當洗脫液體積為30m L時，洗出液中原花青素濃度最大，洗脫液體積70m L時，酒花原花青素基本洗脫完全。

為了確定在以上的條件下洗脫劑的用量多大為最好，可以測量洗脫劑用量與原花青素的回收率關系。

由表2可知，當洗脫劑用量達到70m L時，回收率為86%，洗脫回收率已經接近100%，可認為已經達到洗脫極限，因而可認為在此條件下洗脫劑的最佳用量為70m L。

2.5 利用札一香花和青島大花驗證所選提取條件

由于先期實驗采用的是多酚含量較高的原花青素較高的多酚顆粒酒花為原料，而所建立的大孔吸附樹脂法提取原花青素的目的是為了能檢測酒花中原花青素的含量，為進一步研究酒花及啤酒中原花青素變化做基礎，因而，該方法的通用性至關重要，故以已建立的方法，采用青島大花和札一香花為原料對此方法的普適性進行驗證。

采用乙醇萃取青島大花和札一香花中的原花青素，萃取劑體積分數50%乙醇，萃取溫度為乙醇沸騰(85℃)，料液比為1∶20，萃取時間為2h;用ADS－8大孔樹脂上樣:上樣量 3m L，上樣流速20m L/h，用100%乙醇洗脫，洗脫流速為60m L/h，洗脫劑70m L。得到三種不同酒花提取效果比較如表3所示。

表2 洗脫劑用量與洗脫回收率的關系Table 2 Relationship between eluent dosage and elution recovery rate

表3 三種不同酒花原花青素提取效果比較Table 3 Comparison of procyanidins extract of three different hops

由表3可知，由多酚顆粒得出的提取條件對青島大花和札一香花中原花青素的提取具有較高的回收率和洗脫回收率，因而所建立的大孔吸附樹脂提取酒花中原花青素的方法具有較高的普適性，可以用于分離提取酒花中的原花青素。

3 結論

通過對多酚酒花顆粒中原花青素的提取條件研究，確定了原花青素有機溶劑萃取最佳條件為采用50%乙醇，萃取溫度為乙醇沸騰(85℃)，料液比1∶20，萃取時間為2h。并選定AB－8大孔樹脂進行層析提取，在柱體積為14.5m L，樣品濃度1.8mg/m L時，上樣量3m L，上樣流速20m L/h，洗脫流速60m L/h，70m L 100%乙醇洗脫可得最佳提取效果。

［1］Dalgliesh C E.Flavour stability［Z］.Proceedings of the European Brewery Convention(Amsterdam)，1977(9):623－659.

［2］Noel S，Metais N，Bonte S，et al.The use of oxygen 18 in appraising the impact of oxidation process during beer storage［J］.Journal of the Institute of Brewing，1999，105(5):269－274.

［3］鮑俊竹，陳月坤，徐桂花.測定葡萄籽提取物中原花青素含量的方法［J］.農業科學研究，2005，26(1):43－45.

［4］李春陽，許時嬰，王璋.低濃度香草醛－鹽酸法測定葡萄籽梗中原花青素含量的研究［J］.食品工業科技，2004，25(6): 128－130.

［5］Zhao H，Dong J，Lu J，et al.Effects of extraction solvent mixtures on antioxidant activity evaluation and their extraction capacity and selectivity for free phenolic compounds in barley (Hordeum vulgare L.)［J］.Journal of agricultural and food chemistry.2006，54(19):7277－7286.

［6］Owades J L，Rubin G，Brenner M W.Food tannins measurement，determination of food tannins by ultraviolet spectrophotometry［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1958，6(1):44－46.

［7］Jerumanis J.Separation and identification of flavanoidsby high－performance liquid chromatography(HPLC)［Z］.Proceedings of the Congress－European Brewery Convention，1979:309－319.

［8］Zhu Q Y，Holt R R，Lazarus SA，etal.Stability of the flavan－3－ols epicatechin and catechin and related dimeric procyanidins derived from cocoa［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2002，50(6):1700－1705.

［9］Guyot S，Vercauteren J，Cheynier V.Structural determination of colourless and yellow dimers resulting from(+)－catechin coupling catalysed by grape polyphenoloxidase［J］ . Phytochemistry，1996，42(5):1279－1288.

［10］杜彥山 .葡萄籽綜合利用研究［D］.無錫:江南大學，2006.

［11］趙平，宋學娟，張月萍，等.葡萄籽原花青素提取動力學研究［J］.食品科學，2010(1):110－112.

［12］耿艷輝，周站云，郭月玲，等.大孔吸附樹脂在天然藥物研究中的應用［J］.河北化工，2008，31(5):18－20.

［13］紀小燕，王玉，丁兆堂，等.大孔吸附樹脂對茶多酚和咖啡堿吸附及洗脫性能的研究［J］.食品工業科技，2011，32(2): 118－120.

Study on the extraction and purification of hop procyanidins

SHAN Yan1，2，LIYong－xian1，2，ZHENG Fei－yun1，2，LIU Chun－feng1，2，LIQi1，2，*
(1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi214122，China; 2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi，214122，China)

The extrac tion and purification methods of hop p rocyanid ins were estab lished.The op tim um organic solvents extraction cond itions were estab lished as follows:pH=4.0～4.2，50%ethanol(v/v)as solvent，ratio of solvent tom aterial20∶1(v∶w)，extraction at85℃for2h.Then the crude p roanthocyanidins from hop were purified by using column chromatog raphy(φ10×200mm).5 kinds mac roporous resins were stud ied and com pared，and AB－8 resin was selected for its excellent adsorp tion and desorp tion p roperties.The most app rop riate adsorp tion conditions of AB－8 were:column volume 14.5m L，sam p le concentration 1.8mg/m L，sam p le volume 3m L，sam p le flow velocity 20m L/h.The adsorbed hop p roanthocyanid ins could be well eluted by 100%ethanol of 70m L elution volum e under 60m L/h elution rate.

hop;p roanthocyanid ins;extrac tion;purification

TS261.9

B

1002－0306(2012)12－0272－05

2011－10－24 *通訊聯系人

單巖(1985－)，女，碩士研究生，研究方向:釀酒科學與技術。

教育部新世紀人才資助計劃;江蘇高校優勢學科建設工程資助項目(PAPD);國家創新基金(09C26213203751);江蘇省創新基金(BC2009291)。