基于響應面法優化釀酒黃水酶促酯化條件的研究

陳 帥，劉琨毅，鄭 佳，金 揚，黃 鈞，周榮清，2，3，*

(1.四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川成都 610065; 2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610065; 3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000)

基于響應面法優化釀酒黃水酶促酯化條件的研究

陳 帥1，劉琨毅1，鄭 佳1，金 揚1，黃 鈞1，周榮清1，2，3，*

(1.四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川成都 610065; 2.四川大學輕紡與食品學院，四川成都 610065; 3.國家固態釀造工程技術研究中心，四川瀘州 646000)

優化了釀酒黃水的酶促酯化條件。以乙醇體積分數、pH、紅曲酯化酶活力和反應時間為因子，應用響應面法得到了總酯產量達最大時的工藝條件。由多重回歸分析和方差分析的結果可知，實驗數據與所得二次多項式方程的擬合度較高。由從數學模型得到的3－D響應面圖所確定的黃水酶促酯化的最優條件為:乙醇體積分數22.64%，pH2.77，紅曲酯化酶活力283.00mg/100mL，反應時間為20d。在(32±0.2)℃條件下，黃水發酵液中的總酯含量由發酵前的(0.82±0.06)g/L提高到(6.90±0.14)g/L。

紅曲霉，黃水，響應面，優化，總酯

響應面分析法(RSM)［1－3］采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，通過對函數響應面分析，精確研究各因子與響應值之間的關系，尋求最優工藝參數，解決多變量優化問題。采用該方法優化，具有實驗次數少、周期短、精度高等特點，可快速有效地確定多因子系統的最佳條件［4］，現已被廣泛應用于食品、生物、醫藥等領域［5－7］。紅曲霉的粗酯化酶［8］，可有效促進醇酸縮合酯化，提高酯類組分含量，已廣泛應用于白酒釀造中，成為白酒釀造領域中研究的熱點之一［9］。濃香型白酒發酵過程形成的黃水中含有醇、醛、酯等多種芳香組分及前體物質，應用生物法將其轉化為生物酯化液［10］，不僅縮短了酯化時間，而且有針對性地提高了與濃香型白酒主體香味物質相同組分的轉化率，是實現高值化轉化的有效途徑［11］。本文應用RSM法優化了紅曲霉酯化酶酶促釀酒黃水的酯化條件，研究結果為黃水資源化利用技術的生產應用奠定了實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 微生物菌株 紅曲霉As 3.972，購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。1.1.2 主要試劑與儀器 正己酸、無水乙醇、NaOH、H2SO4均為分析純;糙米 本地農貿市場;麥芽汁

自制;黃水樣品 取自瀘州老窖股份有限公司; PHS－3C精密酸度儀 上海大浦儀器廠;DHP－9162電熱恒溫培養箱 上海一恒醫療器械廠;78－1加熱攪拌器 江蘇省金壇市醫療儀器廠。

1.2 培養基

1.2.1 麥芽汁培養基 麥芽糖度10°Bx，瓊脂2%。

1.2.2 種子培養 500m L三角瓶中裝入25g蒸至無白心的糙米，用10m L 3%的醋酸液洗脫斜面培養基上的菌絲，接入1m L菌懸液，于(32±0.2)℃培養。以上培養基均在121℃下滅菌20m in備用。

1.3 實驗方法

1.3.1 紅曲霉酯化酶的制備 參考文獻［12］所述方法，將500g糙米常壓蒸至無白心后，冷卻到40℃以下，置入25cm×45cm曲盤中，接入4%紅曲種子，(32±0.2)℃，每日換濕紗布等調整濕度，培養14d后，(42±0.2)℃干燥24h。

1.3.2 紅曲酯化力的測定 參考文獻［12］所述方法，將5.0g紅曲粉，99m L 20%(體積分數，下同)乙醇，1m L正己酸分別加入250m L圓底燒瓶中，(32± 0.2)℃酯化100h后，加入蒸餾水50m L，緩火蒸餾出100m L餾出液。取50m L餾出液移至250m L三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液中和至pH7.0，加入25m L 0.1mol/L NaOH溶液，冷凝回流皂化30m in后迅速冷卻至室溫。用0.1mol/L H2SO4溶液滴定至pH7.0，由下式計算酯化力。

式中:m為紅曲質量，g;144為己酸乙酯的摩爾質量，g/mol;C1為NaOH濃度，mol/L;V1為皂化時加入的NaOH體積，m L;C2為H2SO4濃度，mol/L(1/2 H2SO4);V2為滴定消耗H2SO4體積，m L;V總為餾出液總體積，m L。

1.3.3 黃水的酯化方法 調整黃水中乙醇體積分數、pH，加入適量的紅曲粉(換算成對應的酶活力)，于(32±0.2)℃酯化一定天數。紅曲酯化酶活力(mg/100m L)=100m L黃水中加入的紅曲質量(g)× 28.30(20%乙醇下的紅曲酯化力，mg/g)。

1.3.4 發酵液總酯的測定方法 參考文獻［13］所述方法，將100m L發酵液和50m L蒸餾水置于250m L圓底燒瓶中，緩火蒸餾出100m L餾出液。取50m L餾出液移至250m L三角瓶中，用0.1mol/L NaOH溶液中和至pH7.0，加入25m L 0.1mol/L NaOH溶液，冷凝回流皂化30m in后迅速冷卻至室溫。用0.1mol/L H2SO4溶液滴定至pH7.0，由下式計算所含總酯量。

式中:總酯以己酸乙酯計，1.44為換算系數;C1為NaOH濃度，mol/L;V1為皂化時加入的NaOH體積，m L;C2為H2SO4濃度，mol/L(1/2 H2SO4);V2為滴定消耗H2SO4體積，m L;V總為餾出液總體積，m L。

1.4 實驗設計

1.4.1 全因子實驗設計(Full Factorial Design) 以100m L黃水作為基質，其中的乙醇體積分數(X1)、pH(X2)、紅曲酶活力(X3)和反應時間(X4)作為實驗因子，通過4因子2水平的24設計(表1)，中心點做4次重復實驗，共進行20次實驗。并根據實驗數據回歸分析確定最陡爬坡方向，由此接近最大響應區域［14］。

表1 全因子實驗設計因子及編碼值Table 1 Factors and coded data of full factorial design

1.4.2 最陡爬坡實驗(Steepest Ascent Design) 根據全因子實驗的結果和一階模型回歸系數的符號和大小來設計顯著因素的最陡爬坡路徑，從而逼近最大理想區域。最陡爬坡實驗以實驗值變化的梯度方向為爬坡方向，根據各因素效應值的大小確定變化步長，能快速、有效地逼近最大理想區域［15］。

1.4.3 中心組合設計(Central Composite Design) 中心組合設計法是較常用的RSA法，適用于2～5個因素的優化實驗。對影響黃水發酵產酯的顯著因素進行研究，用多項式回歸分析對實驗數據進行擬合，得到二次多項式，該方程即為描述響應量與自變量關系的經驗模型［16］，并對該模型在最佳發酵條件下進行驗證實驗。

1.5 數據處理

采用統計學軟件SAS Version 8.1對實驗數據進行回歸擬合并對擬合方程作顯著性檢驗及方差分析。

2 結果與討論

2.1 乙醇濃度對紅曲酯化力的影響

反應液中乙醇體積分數分別為0%、5%、10%、15%、20%、30%，其余參數不變。由圖1可知，乙醇濃度從0%增至10%時，酯化力迅速增大并達到最大值(44.42mg/g)，繼續提高反應體系中乙醇的濃度，則酯化力顯著降低，乙醇的濃度為30%時，降至25.38mg/g。當乙醇從10%提高到15%，導致蛋白質變性，酯化酶活力降低，所以酯化力顯著降低［17］，繼續提高乙醇濃度，底物濃度促進酯化反應速率提高，部分抵消了因酶促反應速率降低的結果，所以酯化力降低的幅度變緩。

2.2 pH對紅曲酯化力的影響

反應液中乙醇體積分數固定為10%，反應體系的pH分別調節為2.63、3.13、3.63、4.13、4.63，酯化力的變化如圖2所示。pH由2.63增加到3.63時，酯化力迅速提高并達到最大值(36.94mg/g)，繼續將反應體系的pH升至4.63時，酯化力則顯著降低。pH升高使酯化酶的活力降低導致其酯化力減小。

表3 全因子實驗參數估計表Table 3 Parameter estimate of full factorial design

表4 全因子實驗方差分析表Table 4 Variance analysis of full factorial design

圖1 乙醇濃度對酯化力的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on esterifying

圖2 pH對酯化力的影響Fig.2 Effect of pH on esterifying power

2.3 全因子實驗設計及結果

通過24全因子實驗設計方案從眾多因子中篩選出對發酵影響最顯著的因素。考察乙醇體積分數(X1)、pH(X2)、紅曲酯化酶活力(X3)和反應時間(X4)對黃水發酵的影響，全因子設計實驗及結果見表2。

實驗結果表明，改變工藝參數，將引起發酵液中形成的總酯量發生顯著變化。對表2的數據進行回歸分析的結果如表3所示，回歸擬合方程為:

從式(1)可知，反應體系中乙醇體積分數(p= 0.0001＜0.001)和反應時間(p=0.010202＜0.05)是導致總酯變化的主要因素。而pH和紅曲酯化酶活力則為次要影響因子。乙醇體積分數(X1)和反應時間(X4)的系數為正，pH(X2)系數為負值，表明適當增加乙醇濃度，延長反應時間和降低pH有助于總酯含量的提高。由對該模型的方差分析(表4)可知，p=0.000112，R2=95.01%，由此可見該回歸方程模型的擬合度較高，模型與實際情況比較符合，能做出相對準確的預測。

表2 全因子實驗設計及實驗結果Table 2 Design and results of full factorial experiment

2.4 最陡爬坡實驗

根據式(1)及表3的分析結果確定最陡爬坡方向。乙醇體積分數(X1)、反應時間(X4)和pH(X2)對總酯的影響最為顯著。并且X1和X4的系數為正，X2的系數為負，這說明適當增加乙醇體積分數，延長反應時間并適當降低pH對增加總酯含量有促進作用，以全因子實驗的中心點作為最陡爬坡實驗的起點，實驗設計及結果見表5。

2.5 中心組合設計

由以上最陡爬坡實驗的結果可以得到總酯接近最大響應值的區域。以最陡爬坡實驗的最優值(表 5)為中心，采用二次回歸旋轉中心組合設計對實驗進行分析，實驗設計及結果見表6和表7。

表8 中心組合實驗參數估計表Table 8 Parameter estimate of central composite design

表9 中心組合實驗方差分析表Table 9 Variance analysis of central composite design

表5 總酯爬坡實驗及結果Table 5 Design and results of the steepest ascent experiment of total ester

表6 中心組合實驗設計因子及編碼值Table 6 Factors and coded data of central composite experiment

通過SAS Version 8.1軟件對表7的實驗數據進行多項式回歸分析，得到二次多項式擬合方程:

回歸模型方差分析見表8～表9。

由上述結果可以獲得二次模型中各因素的顯著性:X2(pH)對總酯的含量影響極顯著，X1(乙醇體積分數)，X4(發酵時間)不顯著;X1X4對總酯含量影響極顯著，X2X4顯著，X1X2不顯著極顯著4顯著。由式(2)可知，二次項的系數為負，而系數為正，故由X1和X2表征的拋物面開口向下(圖3)，此時有極大值點。取x4=0(X4=20)，帶入式(2)中，通過函數求極大值的方法得出:x1=0.07 (X1=22.64%)、x2=－0.04(X2=2.77)時，預測值為6.59。表7中實驗9(X1=27)和10(X1=29)的結果分別僅較預測值高出1.64%和4.64%，這說明在發酵后期總酯含量的增加變得緩慢，反應時間的延長對總酯含量的促進作用基本可以忽略不計，因此，在前述求極值過程中將X4取為20是可行的。另外，R2= 97.98%，表明該模型能夠較好地解釋總酯產量隨著乙醇體積分數、pH的變化而變化。

表7 總酯中心組合實驗設計及結果Table 7 Design and results of central composite experiment of total ester

2.6 模型的驗證

在2.5中所確定的最佳發酵條件下(極大值點處)進行3次黃水發酵產酯驗證實驗，結果顯示，發酵液中的總酯含量達到(6.90±0.14)g/L，與預測值6.59g/L僅相差4.72%，說明該模型對黃水發酵產酯具有一定的實際指導意義。

圖3 乙醇體積分數(X1)和pH(X2)對總酯含量影響的響應面圖Fig.3 Response surface graph of ethanol concentration and pH on total ester

3 結論

3.1 反應液中乙醇濃度和pH對紅曲酯化力的影響較大，且這兩種因素能顯著影響經紅曲粗酯化酶催化的黃水發酵液中的總酯產量，由最陡爬坡實驗結果可知，當乙醇濃度低于17.5%時，與總酯產量呈現明顯的正相關關系，當pH低于3.15時，則呈現負相關關系。

3.2 應用響應面法優化紅曲粗酯化酶酶促黃水產酯的最佳工藝條件為:乙醇體積分數22.64%，發酵液初始pH2.77，紅曲酯化酶活力283.00mg/100m L，反應時間20d。采用最優條件酯化黃水后，其總酯含量為(6.90±0.14)g/L，與預測值 6.59g/L僅相差4.72%，說明實驗值與模型預測值基本相符，證明了該模型的有效性以及對黃水資源化利用具有一定的實際指導意義。

［1］MYERSR H，MAYSD P.Design and analysis for a two－level factorial experiment in the presence of variance heterogeneity［J］.Computational Statistics＆Data Analysis，1997，26(2): 219－233.

［2］MYERS R H，WARDROP D M.Some response surface designs for finding optimal conditions［J］.Journal of Statistical Planning and Inference，1990，25(1):7－28.

［3］MYERS R H，MONTGOMERY D C.Response surface methodology:process and product optimization using designed experiments［M］.New York:Wiley，2002.

［4］KALIL SJ，MAUGERIF，RODRIGUESM I.Response surface analysis and simulation as a tool for bioprocess and optimization［J］.Process Biochemistry，2000，35:539－550.

［5］TOMPSON D R.Response surface experimentation［J］. Journal of Food Processing and Preservation，1982，6(3): 155－188.

［6］YIN Xiulian，YOU Qinghong，JIANG Zhonghai［J］. Optimization of enzyme assisted extraction of polysaccharides fromTricholomamatsutakeby response surface methodology. Carbohydrate Polymers，2011，86(3):1358－1364.

［7］KHAYET M，COJOCARU C，ESSALHIM.Artificial neural network modeling and response surface methodology of desalination by reverse osmosis［J］.Journal of Membrance Science，2011，368(1－2):202－214.

［8］吳衍庸.紅曲酯化酶新技術及在中國白酒上的應用［J］.釀酒科技，2004(6):29－32.

［9］朱效剛.紅曲功能性成分分析及發酵法生產的研究［D］.無錫:江南大學.2005.

［10］劉賓，陳義倫，于忠良.黃水酯化液酶法制備研究［J］.中國食品學報，2009，9(2):116－121.

［11］吳衍庸，郭世則，盧世珩，等.濃香型酒己酸乙酯合成的生物學研究［J］.食品與發酵工業，1990(5):1－3.

［12］彭熙敏，黃著，劉超蘭，等.紅曲霉培養條件對酯化力影響的研究［J］.釀酒科技，2009(1):17－20.

［13］沈怡方.白酒生產技術全書［M］.北京:中國輕工業出版社，2007:658－660.

［14］KHAYET M，COJOCARU C，ESSALHIM.Artificial neural network modeling and response surface methodology of desalination by reverse osmosis［J］.Journal of Membrane Science，2011，368(1－2):202－214.

［15］DJOUDIW，AISSANI－Benissad F，BOUROUINA－Bacha S. Optimization of copper cementation process by iron using central composite design experiments［J］.Chemical Engineering Journal，2007，133(1－3):1－6.

［16］ASLAN N.Application of response surface methodology and central composite rotatable design formodeling and optimization of amulti－gravity separator for chromite［J］.Powder Technology，2008，185(1－2):80－86.

［17］MALCATA F X，REYESH R，GARCIA H S，et al.Kinetics and mechanisms of reactions catalysed by immobilized lipases［J］.Enzyme and Microbial Technology，1992，14(6):426－446.

Study on enzymatic esterification conditions of yellow water optim ized by response surface methodology

CHEN Shuai1，LIU Kun－yi1，ZHENG Jia1，JIN Yang1，HUANG Jun1，ZHOU Rong－qing1，2，3，*
(1.National Engineering Laboratory for Clean Technology of Leather Manufacture，Chengdu 610065，China; 2.College of Light Industry，Textile＆Food Engineering，Sichuan University，Chengdu 610065，China; 3.National Engineering Research Center of Solid－State Brewing，Luzhou 646000，China)

The researches on the op tim ization of esterification cond itions of yellow water，a kind of concom itant during liquor brew ing p rocess，was carried out.Response surface m ethodology(RSM)，based on a two level，four variab le central com posite design(CCD)，was emp loyed to ob tain the best possib le combination of ethanol concentration，pH，esterase activity and reaction time formaximum totalester.The experimentaldata obtained was coincided with a second－order polynom ial equation using m ultip le reg ression analysis and also were analyzed by analysis of variance(ANOVA).The 3－D response surface p lot and the contour p lot derived from the mathematical models were app lied to determ ine the op timal cond itions.The op timum enzym atic esterification cond itions were: ethanol concentration of 22.64%，pH2.77，esterase activity of 283.00mg/100m L and reaction time of 20d.Under the cond ition of(32±0.2)℃，the experimentalyield of total ester was(6.90±0.14)g/L compared w ith initial(0.82± 0.06)g/L in the yellow water.

monascus;yellow water;response surface methodology;op tim ization;totalester content

TS261

A

1002－0306(2012)12－0205－05

2011－09－19 *通訊聯系人

陳帥(1986－)，男，碩士研究生，研究方向:現代發酵技術。

國家自然科學基金(31171742);四川省重大攻關項目(09ZC0735)。