固定化葡萄糖異構酶活化條件對其酶活的影響

胡 弢，周雪艷，趙國群

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018)

固定化葡萄糖異構酶活化條件對其酶活的影響

胡 弢，周雪艷，趙國群

(河北科技大學生物科學與工程學院，河北石家莊 050018)

固定化葡萄糖異構酶在使用前需先進行活化，從而使酶發揮其最佳催化功效。本文從糖液濃度、溫度、pH、活化時間和金屬離子五個方面研究了活化條件對GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構酶酶活的影響。該酶的最適活化條件為:葡萄糖液濃度60%、溫度55℃、pH 7.5、時間4h。經此條件活化之后，其酶活達815U/g，與常規活化條件相比，酶活提高了40%以上。固定化葡萄糖異構酶活化時不宜加入Mg2+、Co2+、Mn2+和Zn2+。

活化，果葡糖漿，固定化葡萄糖異構酶

果葡糖漿是一種新發展起來的淀粉糖品，廣泛應用于食品工業，尤其是軟飲料工業［1－2］。工業上一般采用玉米淀粉為原料，先經過雙酶液化和糖化，轉化為葡萄糖溶液，然后采用固定化葡萄糖異構酶進行異構化反應，得到果糖和葡萄糖的混合液即果葡糖漿［3］。因此，葡萄糖異構酶是果葡糖漿生產中的一個關鍵酶，其酶活的高低直接影響著生產效率和生產成本。為了方便儲運及較高的穩定性，固定化葡萄糖異構酶的商品形態多為干燥的顆粒，其中只含極少量的水，因此酶顆粒使用前需進行活化(水化)。活化過程就是用底物(葡萄糖漿)來使酶顆粒吸收水分，從而使酶發揮其催化功效［4］。如果活化條件不適當，固定化葡萄糖異構酶就不能獲得理想的酶活，從而影響其催化效率。關于葡萄糖異構酶的固定化方法、穩定性和反應條件對其催化性能影響的研究很多，但是關于固定化葡萄糖異構酶使用前的活化研究卻少有報道［5－7］。本文對以果葡糖漿生產上普遍使用的GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構酶的最佳活化條件進行了研究，以期提高活化后的酶活，進而提高葡萄糖異構為果糖的生產效率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構酶(簡稱異構酶) 無錫杰能科生物制品有限公司，粒徑300～1200，淺棕黃色;葡萄糖 分析純，石家莊華營葡萄糖有限公司;果糖 分析純，天津市永大化學試劑開發中心;MgSO4分析純，天津市大茂化學試劑廠;ZnSO4分析純，天津市化學試劑三廠;CoSO4、MnSO4分析純，天津市博迪化工有限公司。

Ajilent 1100高效液相色譜儀 配示差折光檢測器和Rev.A.10.02色譜工作站，美國安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 活化時間對異構酶酶活的影響 配制濃度為30%的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L的NaOH溶液調pH到7.5。取5支試管，每支試管中加入0.2g異構酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，然后將試管置于40℃水浴鍋中分別浸泡(活化)0、1、2、3、4、5h。傾倒、瀝干糖液，測定酶活。

1.2.2 糖液濃度對異構酶酶活的影響 分別配制濃度為30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L NaOH溶液調pH到7.5。取5支試管，每支試管中加入0.2g異構酶和5mL所配制的葡萄糖溶液。將試管置于40℃水浴鍋中活化4h。傾倒、瀝干糖液。

1.2.3 溫度對異構酶酶活的影響 配制濃度為60% (W/V)的葡萄糖溶液100mL，用0.2mol/L NaOH溶液調pH到7.5。取4支試管，每支試管中加入0.2g異構酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，分別在25、35、45、55、70℃水浴鍋中活化4h。

1.2.4 糖液pH對異構酶酶活的影響 分別將60%葡萄糖溶液的pH調整為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5。取5支試管，每支試管中加入0.2g異構酶和5mL所配制的葡萄糖溶液，然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4h。

1.2.5 金屬離子對異構酶酶活的影響 配制濃度為60%的糖液400mL，用NaOH溶液調pH到7.5，并均分到 4個燒杯中，然后分別添加 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4配制成1.0mmol/L的葡萄糖液。取4支試管，每支試管中加入0.2g異構酶和5mL配制好的含金屬離子葡萄糖溶液，然后將試管置于55℃水浴鍋中活化4h。

1.3 分析方法

1.3.1 固定化葡萄糖異構酶酶活的測定 本實驗按照GB8274－87(固定化葡萄糖異構酶制劑)中所示的方法測定葡萄糖異構酶的酶活。0.2g固定化葡萄糖異構酶在葡萄糖溶液活化之后，傾倒、瀝干糖液，加磷酸緩沖液1.5mL，硫酸鎂溶液0.5mL，葡萄糖溶液1.5mL，再加去離子水調整至總體積5mL，70℃反應1h，加高氯酸溶液5mL終止反應，用高效液相法測定其中果糖含量。異構酶的酶活力定義為:在pH為7.5，溫度為70℃的條件下，每小時生成1mg果糖所需的最小酶量為1個酶活力單位。

異構酶酶活(U/g)=果糖濃度(mg/mL)×稀釋倍數×10/酶質量

1.3.2 果糖含量的測定 本實驗采用高效液相色譜法來測定果葡糖漿中果糖的含量。其檢測條件為: Waters Sugar－Park色譜柱，示差折光檢測器，流速0.5mL/min，溫度70℃，流動相純水，流速0.5mL/min，進樣量20.0μL。

2 結果與討論

2.1 活化時間的影響

將固定化葡萄糖異構酶浸泡在30%葡萄糖溶液(40℃)中進行活化，控制不同的活化時間，然后測定其酶活，結果見圖1。從圖1中發現，活化1h的異構酶酶活明顯低于未經活化的異構酶。隨著活化時間的延長，異構酶酶活逐漸提高。當活化時間為4h時，其酶活達到最高為720.3U/g。然而，當活化時間延長到5h時，酶活又顯著下降，低于未經活化的異構酶。為了方便儲存和運輸，異構酶固定化后生產為干態。在干燥過程中，異構酶因失水而發生空間構象的變化，進而影響其酶活。在葡萄糖溶液中進行活化時，異構酶的空間構象趨于恢復原態，其恢復的程度可能與活化時間、活化溫度、糖液濃度等有關，也可能與固定化時使用的固定載體有關。可能正是這些影響因素不恰當組合，使得活化后的異構酶空間構象恢復的不理想或最佳空間構象未能長時間保持，從而活化時間過短或過長均造成異構酶酶活降低。

圖1 活化時間對異構酶酶活的影響Fig.1 Effect of activation time on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

2.2 糖液濃度的影響

在果葡糖漿的生產上，通常使用40%～50%的葡萄糖漿(純度93%)進行活化［4］。考慮到果葡糖漿的實際生產，本實驗采用的活化介質為葡萄糖溶液。將固定化葡萄糖異構酶分別在30%、40%、50%、60%、70%(W/V)的葡萄糖溶液中40℃下活化4h，實驗結果見圖2。如圖2所示，糖液濃度對異構酶酶活有顯著的影響。當糖液濃度為60%時，異構酶酶活最高，達到了811U/g，同40%葡萄糖溶液相比，異構酶酶活提高了233U/g。糖液濃度的高低影響著其中的水分活度。糖液濃度越低，糖液中的水分活度越大，異構酶顆粒越容易吸收水分，復水速度越快。從實驗結果分析，過快或過慢的復水速度都不利于活化后獲得最高酶活。

圖2 糖液濃度對異構酶酶活的影響Fig.2 Effect of syrup concentration on the enzyme activityof immobilized glucose isomerase

2.3 活化溫度的影響

異構酶固定化后，耐溫性增強，但當溫度超過70℃時仍容易變性失活，從而導致酶活降低。因此，生產商建議的活化溫度為25～55℃。如圖3所示，在25～55℃范圍內，隨著糖液活化溫度的升高，異構酶酶活逐漸增加。當活化溫度為55℃時，活化后的酶活最高，達815U/g，同25℃相比，異構酶酶活增加了251.8U/g。當活化溫度超過55℃時，異構酶酶活明顯下降。由實驗結果可知，在實際生產中選擇適宜的活化溫度對提高異構酶酶活很重要。

圖3 活化溫度對異構酶酶活的影響Fig.3 Effect of temperature on the enzyme activityof immobilized glucose isomerase

2.4 糖液pH對異構酶酶活的影響

根據來源不同，異構酶的最適pH有所差異，一般糖異構酶的最適pH在6.5～8.5。由圖4可見，當糖液pH從6.5升高到7.5時，異構酶酶活逐漸升高。pH 7.5與pH 8.0的酶活基本相同。但在堿性條件下高溫(60℃)會使葡萄糖糖漿的顏色加深，所以糖液pH選定7.5為宜。實驗結果還表明，異構酶活化的最適pH與進行酶催化的最適pH基本一致。

圖4 pH對異構酶酶活的影響Fig.4 Effect of pH on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

2.5 金屬離子對酶活的影響

葡萄糖異構酶是金屬酶。在葡萄糖異構化為果糖時，Mg2+、Co2+、Mn2+等對該酶有激活作用，而Ca2+、Hg2+、Cu2+等則起抑制作用［8－9］。為了考察金屬離子在異構酶活化時的影響，在60%葡萄糖溶液中分別添加 1.0mmol/L的 MgSO4、CoSO4、ZnSO4、MnSO4，55℃下活化4h，結果見圖5。由圖5可見，同未加任何金屬離子的對照相比，異構酶活化時添加Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+不但沒有使酶活升高，反而明顯降低了酶活。這說明Mg2+、Co2+、Mn2+、Zn2+在活化時均起抑制作用。造成這種現象的原因可能是活化時添加的金屬離子干擾了異構酶水化過程中最佳空間構象的恢復，從而造成酶活的降低。

圖5 金屬離子對異構酶酶活的影響Fig.5 Effect of metal ions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

3 結論

本實驗以果葡糖漿生產上普遍使用的GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構酶為研究對象，研究了活化條件對其酶活的影響。實驗結果表明活化條件對固定化葡萄糖異構酶酶活有非常顯著的影響。GENSWEETTMIGI－SA固定化葡萄糖異構酶的適宜活化條件為:葡萄糖液濃度60%、溫度55℃、pH7.5、時間 4h。經此條件活化之后，其酶活達815U/g，同酶生產商推薦活化條件(葡萄糖液濃度40%、溫度40℃、pH7.5、時間7h)相比，異構酶酶活提高了40%以上。此外，在固定化葡萄糖異構酶活化時不適宜加入Mg2+、Co2+、Mn2+和Zn2+等金屬離子。

［1］郝建明.果葡糖漿及其生產工藝要點［J］.食品工業科技，2006，27(8):204－205.

［2］扶雄，徐麗霞，羅建勇，等.果葡糖漿中果糖分離方法研究進展［J］.中國甜菜糖業，2008(1):29－32.

［3］李紀亮.F－55高果葡糖漿廠設計和生產［J］.食品工業科技，2008，29(10):170－173.

［4］姜錫瑞，段鋼.新編酶制劑實用技術手冊［M］.北京:中國輕工業出版社，2002:151－154.

［5］葛玉斌，王立平，孔維，等.葡萄糖異構酶的固定化及其性質研究［J］.高等學校化學學報，1996，17(5):735－738.

［6］Lee H S，Hong J.Kinetics of glucose isomerization to fructose by immobilized glucose isomerase:Anomeric reactivity of D－glucose inkinetic model［J］.Journal of Biotechnology，2000，84: 145－153.

［7］Tukel S S，Alagoz D Catalytic efficiency of immobilized glucose isomerase in isomerization of glucose to fructose［J］.Food Chemistry，2008，111:658－662.

［8］陶麗梅，過瑩立，李寧，等.Mg2+、Co2+、Mn2+和Ca2+對葡萄糖異構酶活性的影響［J］.中國生物化學與分子生物學報，1999，15(6):1002－1005.

［9］朱國萍，程陽，宮春紅，等.葡萄糖異構酶的生物工程研究進展［J］.生物化學與生物物理進展，2007，27(2):127－131.

Influence of activation conditions on the enzyme activity of immobilized glucose isomerase

HU Tao，ZHOU Xue－yan，ZHAO Guo－qun
(College of Bioscience and Bioengineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang 050018，China)

Activation was need before immobilized glucose isomerase was used in order to make it have the best catalytic ability.The influences of activation conditions on the enzyme activity of GENSWEETTMIGI－SA immobilized glucose isomerase were studied including concentration of glucose syrup，temperature，pH，activation time and metal ions.The optimal activation condition was as follows:Glucose syrup 60%，temperature 55℃，pH 7.5 and activation time 4h.Under this condition，the enzyme activity of immobilized glucose isomerase was 815U/g，which was 40%higher than one under normal activation condition.Mg2+，Co2+，Mn2+and Zn2+were not necessary to be added into glucose syrup when immobilized glucose isomerase was activated.

activation;high fructose syrup;immobilized glucose isomerase

TS201.3

A

1002－0306(2012)10－0223－03

2011－11－07

胡弢(1977－)，男，講師，博士，研究方向:生物催化技術。