竹黃無性型菌的人工培養(yǎng)研究

韓燕峰，杜 文，梁建東，梁宗琦

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴州貴陽 550025）

竹黃無性型菌的人工培養(yǎng)研究

韓燕峰，杜 文，梁建東，梁宗琦*

（貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院真菌資源研究所，貴州貴陽 550025）

采用培養(yǎng)特征觀察，竹紅菌甲素測(cè)定和分子生物學(xué)等技術(shù)和方法，研究了不同培養(yǎng)基上竹黃菌的生物量，產(chǎn)竹紅菌素甲素和形成子座情況，結(jié)果表明，葡萄糖20g，瓊脂20g，竹汁1000mL（竹枝200g煮沸取濾液），pH自然的培養(yǎng)基中并插入滅菌的竹枝，接入竹黃菌種，7d后，該培養(yǎng)基上菌絲生物量和其竹紅菌素量均為最高，且約6個(gè)月室內(nèi)室溫（0～20℃）培養(yǎng)獲得了類天然竹黃狀的培養(yǎng)物，該培養(yǎng)物經(jīng)過了竹紅菌甲素測(cè)定及分子鑒定分析多途徑的綜合驗(yàn)證。通過本實(shí)驗(yàn)，竹黃無性型菌的人工培養(yǎng)取得一定進(jìn)展。

竹黃菌，竹黃子實(shí)體，人工培養(yǎng)，竹紅菌素，分子鑒定

竹黃菌（Shiraia bambusicolaP.Henn.）是一種主要寄生于短穗竹屬（BrachystachyumKeng）一些種上的子囊菌[1]。竹黃菌的子實(shí)體（竹黃）是一種傳統(tǒng)中藥，它的主要生物活性成分是光療色素——竹紅菌甲素及多糖。其具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗菌、光敏殺傷腫瘤細(xì)胞等多種功能，在醫(yī)藥、食品及植物保護(hù)等領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景[2-6]。近年，又首次從竹黃菌中分離得到9個(gè)化合物，其中11，11-dideoxy verticillin A具有抗腫瘤活性[7]。新分離到的一個(gè)產(chǎn)漆酶菌株，經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)條件后，產(chǎn)漆酶酶活水平達(dá)120000U/L水平，與已報(bào)道的白腐真菌相比，具有發(fā)酵周期短且產(chǎn)漆酶酶活較高的優(yōu)點(diǎn)[8]。特別值得一提的是，研究發(fā)現(xiàn)，竹黃菌不只是某些竹種的專性寄生菌。Zhu等[9]從蛇足石杉中分離到一株能產(chǎn)生石杉?jí)A的內(nèi)生竹黃菌分離體，Shiraiasp.SLf14。他們研究發(fā)現(xiàn)這株竹黃菌能產(chǎn)生具有增強(qiáng)記憶、改善記憶損傷和提高腦力活動(dòng)效率等攻效的一種膽堿酯酶抑制劑——石杉?jí)A。上述發(fā)現(xiàn)不僅提供了開辟生產(chǎn)石杉?jí)A及漆酶的一種新選擇，同時(shí)也為竹黃菌資源的開發(fā)利用拓展了空間。由于竹黃及竹紅菌素應(yīng)用研究成果的推動(dòng)，在新菌株分離篩選[10-11]、分類及系統(tǒng)學(xué)[12-13]、生物學(xué)及遺傳學(xué)[14-15]、液體培養(yǎng)優(yōu)化、竹紅菌素的提取[5，16-17]、原地保育人工接種及固體培養(yǎng)條件等方面的研究都有了新的進(jìn)展。但是對(duì)保護(hù)竹黃自然資源和擴(kuò)大利用范圍有重要價(jià)值的異地培育、成功獲得竹黃子座——子實(shí)體的實(shí)例則未見報(bào)道[18]。本文將報(bào)道作者在添加竹枝的固體培養(yǎng)基上，成功獲得類竹黃子實(shí)體結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)菌株 竹黃菌Shiraia bambusicolaGZDXIFR-181菌株[10]，保存于貴州大學(xué)真菌資源研究所；短穗竹，竹紅菌甲素（純度98%） 南京康滿林公司。

紫外分光光度儀為752型 上海第三分析儀器廠；基因擴(kuò)增與測(cè)序 上海鼎安生物科技有限公司。

1.2 菌株活化及產(chǎn)子實(shí)體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的制備

1.2.1 斜面母種培養(yǎng)基 土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基配制

1.2.2.1 PDA培養(yǎng)基 土豆200g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標(biāo)號(hào)A。

1.2.2.2 PDA培養(yǎng)基+竹枝 土豆200g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標(biāo)號(hào)B。

1.2.2.3 大米玉米培養(yǎng)基+竹枝 大米150g，玉米粉50g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標(biāo)號(hào)C。

1.2.2.4 大米玉米竹汁培養(yǎng)基+竹枝 大米140g，玉米粉40g，竹子20g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標(biāo)號(hào)D。

1.2.2.5 竹汁培養(yǎng)基+竹枝 竹枝200g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標(biāo)號(hào)E。

以上培養(yǎng)基配制好后，分別裝入高11cm、直徑7cm的玻璃瓶和500m L的三角瓶中，每瓶裝入100m L培養(yǎng)基。然后將剪切長(zhǎng)度為8cm的竹枝，以一根稍粗的竹枝作為中心，用棉線捆綁成直徑約為2cm的竹枝束，插入除培養(yǎng)基A外的其余培養(yǎng)基中，1×105Pa滅菌30m in，備用。

1.3 接種培養(yǎng)及培養(yǎng)特征觀察

式中Tmax為當(dāng)代進(jìn)出庫序列中執(zhí)行進(jìn)出庫作業(yè)時(shí)間最大值。以其作為適應(yīng)度參數(shù)，可以保證適應(yīng)度函數(shù)最大的序列作業(yè)時(shí)間最小，同時(shí)淘汰作業(yè)集合中執(zhí)行時(shí)間最長(zhǎng)的序列。

培養(yǎng)基冷卻后，用接種針挑取少許已活化的菌種，接種在已滅菌的培養(yǎng)基中心，接種完成后用封口膜封好。置于26℃的恒溫箱培養(yǎng)。第7d描述并記錄菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)竹紅菌素的情況。

1.4 生物量測(cè)定方法

培養(yǎng)7d后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量記載竹黃菌在不同培養(yǎng)基上的菌落直徑，觀察菌絲的生長(zhǎng)情況。之后刮下培養(yǎng)基上的氣絲菌絲，置于已烘干恒重的紙片上，再一起放入50℃的干燥箱，24h后取出，溫度降至室溫（約20℃）后，于精密天平上稱重，記錄。

1.5 竹紅菌甲素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確稱取竹紅菌甲素標(biāo)準(zhǔn)品10mg，置于10m L容量瓶中，用無水乙醇溶解、搖勻，并定容至刻度，得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用無水乙醇稀釋成10、20、50、100μg/m L系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液各200μL，在紫外分光光度儀465nm下測(cè)定吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.6 處理樣品竹紅菌甲素的提取及測(cè)定

參照杜文等方法進(jìn)行[4]，按竹黃菌干重∶無水乙醇=10∶6（mg∶m L）的比例，浸提24h，3000r/min離心，取上清液，用紫外分光光度計(jì)于波長(zhǎng)465nm測(cè)定吸光度，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線查值并計(jì)算竹紅菌甲素的含量。

將待測(cè)材料按照Tigano-M ilani方法提取基因組DNA。對(duì)其ITS-5.8S區(qū)域采用ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5（GGAAGTAAAA GT CG TAACAAGG）進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，將菌株測(cè)得的ITS序列于GenBank上進(jìn)行BLAST比對(duì)，選擇相似性大于93%的菌株及其序列用CLUSTALX1.81作完全比對(duì)，經(jīng)手工校正后，用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)樹進(jìn)行分子鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

通過回歸計(jì)算，其回歸方程為Y=0.1669X-0.0004（R2=0.9984），其中X為465nm下的吸光度，Y為竹紅菌甲素的含量（mg/m L），竹紅菌甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。從圖1可見，此標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系較好。可用于本實(shí)驗(yàn)的各項(xiàng)測(cè)定。

圖1 竹紅菌甲素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of hypocrellin A

2.2 竹黃無性型菌株的培養(yǎng)特征

在各培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d，氣生菌絲呈絮狀或絨毛狀，呈白色（圖2）；培養(yǎng)10d后，菌落中央顏色變深，菌落天鵝絨狀，紅色素開始分泌，繼續(xù)培養(yǎng)菌落顏色由白色逐漸轉(zhuǎn)變成灰白色，菌落背面顏色變紅褐色。其中，E號(hào)培養(yǎng)基（竹汁+竹枝）不僅菌絲生長(zhǎng)豐滿，且氣生菌絲肉紅色。

圖2 在不同培養(yǎng)基上竹黃菌的生長(zhǎng)差異Fig.2 Growth differencesof Shiraiabambusicola on severalmedias

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)竹黃菌生長(zhǎng)和產(chǎn)竹紅菌甲素的影響

不同培養(yǎng)基中竹枝對(duì)竹黃菌生物量和產(chǎn)竹紅菌甲素的影響結(jié)果見圖3。從圖3看出，在PDA（A）和竹汁+竹枝（E）兩種有植物液的培養(yǎng)基上，竹黃菌的生長(zhǎng)速度、生物量和竹紅菌素的產(chǎn)量都較高。而在以大米玉米為基礎(chǔ)的碳源豐富的培養(yǎng)基上（C和D），即使加入竹枝誘導(dǎo)，其竹紅菌素的含量和重量都最低。這或許提供了啟示，植物浸出液中的其他生物活性物質(zhì)對(duì)菌的生長(zhǎng)和竹紅菌素的形成有重要作用。

圖3 不同培養(yǎng)基對(duì)竹黃菌生物量及產(chǎn)竹紅菌甲素的影響Fig.3 Effectof severalmedias on the biomass and hypocrellin A production of Shiraia bambusicola

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)竹黃菌子實(shí)體的影響

各種實(shí)驗(yàn)用培養(yǎng)基經(jīng)過6個(gè)月室溫（0～20℃）的培養(yǎng)，僅見E培養(yǎng)基中產(chǎn)生約7個(gè)/瓶的團(tuán)塊狀類子實(shí)體結(jié)構(gòu)（S.bambusicola-like fruit body）（圖4），灰白色，大小不同的類子實(shí)體的長(zhǎng)寬范圍為6.9~11.5mm，切開后內(nèi)部灰黑色。制片觀察未見產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和孢子。采用前述方法測(cè)定竹紅菌素的含量為10.27mg/L。

圖4 人工培養(yǎng)基上的類竹黃子實(shí)體結(jié)構(gòu)Fig.4 S.bambusicola-like fruitbody on an artificialmedium

將形成的子實(shí)體提取DNA和PCR擴(kuò)增、測(cè)序，于GenBank上進(jìn)行BLAST，下載相近序列和作者分離確定的GZDXIFR-181和GZDXIFR-171竹黃菌株序列建立系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）進(jìn)行分子鑒定分析。從系統(tǒng)發(fā)育樹可清楚觀察到，人工培養(yǎng)的子實(shí)體與全部已知竹黃菌序列聚在一個(gè)進(jìn)化分支中（支持率達(dá)99%）。分子證據(jù)有力驗(yàn)證了人工培養(yǎng)產(chǎn)生的類竹黃子實(shí)體結(jié)構(gòu)是培養(yǎng)接種竹黃菌的培養(yǎng)物。在以竹汁為基礎(chǔ)培養(yǎng)基上加入竹枝人工培養(yǎng)竹黃子實(shí)體獲得了明顯進(jìn)展。

其次，B~E培養(yǎng)基都添加竹枝，只有培養(yǎng)基E中產(chǎn)生了該結(jié)構(gòu)，其余均未見。因此從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，添加竹枝未必是產(chǎn)生子實(shí)體的主要因素。而通過過濾煮沸的竹枝獲得的竹汁中，某些成分有可能刺激竹黃子實(shí)體的形成，有待進(jìn)一步研究。

圖5 人工培養(yǎng)子實(shí)體與GenBank中已知竹黃菌ITS序列構(gòu)建的Mp系統(tǒng)發(fā)育樹（Mega4.0）Fig.5 Phylogenetic tree（Mp）from Ac-fruitbody and GenBank sequences of Shiraia bambusicola（Mega.4.0）

3 結(jié)論與討論

林海萍[19]在含竹筍50%，棉籽殼25%，米糠20%，玉米粉1%，蔗糖1%，CaCO32%，MgSO40.25%，KH2PO40.5%培養(yǎng)基中，試管培養(yǎng)約35d后，菌絲變紅，長(zhǎng)出原基，最后在培養(yǎng)料的頂部長(zhǎng)出淺灰色的塊狀物，切片后見有分生孢子，但未檢測(cè)到竹紅菌素形成。而后再未見成功培養(yǎng)報(bào)道。因而假定子實(shí)體是否含有竹紅菌素成了一個(gè)重要的判別指標(biāo)。但最新研究發(fā)現(xiàn)，一種常見的產(chǎn)黃青霉Penicillium chrysogenum Thom也能形成竹紅菌素[20]。因此，以形成竹紅菌素作為唯一判別指標(biāo)也有失偏頗。作者在研究中應(yīng)用了解剖觀察、竹紅菌素形成和分子鑒定相結(jié)合的多途徑方法更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡M(jìn)行了考證。雖然解剖觀察未見孢子，但產(chǎn)竹紅菌素的結(jié)果和分子分析支持了作者培養(yǎng)獲得的類竹黃子實(shí)體結(jié)構(gòu)或許是未成熟的竹黃子實(shí)體。

現(xiàn)有研究已表明，竹的主要成分（90%以上）是纖維素和木質(zhì)素，其他是少量的水、有機(jī)抽提物和灰分[21]。在不同竹種間及同種的不同部位，它們的同一化學(xué)成分含量都不同，特別是各種抽提物和灰分變異更大[22]。作者培養(yǎng)基中所用的竹種非原產(chǎn)地被竹黃菌寄生的短穗竹，且培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分也較為貧乏。這可能是未能獲得成熟子實(shí)體的原因之一。另一原因可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)而使培養(yǎng)基干燥，也阻礙了培養(yǎng)物的進(jìn)一步生長(zhǎng)發(fā)育。因此進(jìn)一步的研究應(yīng)考慮加富培養(yǎng)基和來自同一生境中共棲菌的應(yīng)用。

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Artificial culture of the anamorph of Shiraia bambusicola

HAN Yan-feng，DUW en，LIANG Jian-dong，LIANG Zong-Qi*
（Institute of Fungus Resources，College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The biomass，hypoc rellin A and form ing fruitbody of Shiraia bambusicola on the d ifferentmed ias were exp lored.Through the method of culture characters，hypoc rellin A determ ination and molecular biology，the results showed thatm ycielia biomass and hypocrellin A were the best on the med ium consisting of g lucose 20g，agar 20g，bamboo filter liquor（bamboo pole 200g boiled）1000m L，and inserted sterile bumboo poles；And on above medium，S.bambusicola-like fruit bod ies were ob tained when the strain were inoculated and cultivated under the room temperature（0～20℃）lasting six months.S.bambusicola-like fruit bodies were confirmed by hypoc rellin A determ ination and molecular identification.The experiments showed that the fruit body of S.bambusicola on artificial culture made p rog ress.

Shiraia bambusicola；fruitbody；artificial culture；hypocrellin a；molecular identification

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0239-04

2012－02－20 *通訊聯(lián)系人

韓燕峰（1978－），女，博士，副教授，主要從事真菌資源及其利用方面的研究。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30960004）；貴州省自然科學(xué)基金項(xiàng)目[黔科合字（2008）2266號(hào)]；貴州大學(xué)引進(jìn)人才科研項(xiàng)目[貴大人基合字（2007）035號(hào)]。