竹黃無性型菌的人工培養研究

韓燕峰，杜 文，梁建東，梁宗琦

（貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，貴州貴陽 550025）

竹黃無性型菌的人工培養研究

韓燕峰，杜 文，梁建東，梁宗琦*

（貴州大學生命科學學院真菌資源研究所，貴州貴陽 550025）

采用培養特征觀察，竹紅菌甲素測定和分子生物學等技術和方法，研究了不同培養基上竹黃菌的生物量，產竹紅菌素甲素和形成子座情況，結果表明，葡萄糖20g，瓊脂20g，竹汁1000mL（竹枝200g煮沸取濾液），pH自然的培養基中并插入滅菌的竹枝，接入竹黃菌種，7d后，該培養基上菌絲生物量和其竹紅菌素量均為最高，且約6個月室內室溫（0～20℃）培養獲得了類天然竹黃狀的培養物，該培養物經過了竹紅菌甲素測定及分子鑒定分析多途徑的綜合驗證。通過本實驗，竹黃無性型菌的人工培養取得一定進展。

竹黃菌，竹黃子實體，人工培養，竹紅菌素，分子鑒定

竹黃菌（Shiraia bambusicolaP.Henn.）是一種主要寄生于短穗竹屬（BrachystachyumKeng）一些種上的子囊菌[1]。竹黃菌的子實體（竹黃）是一種傳統中藥，它的主要生物活性成分是光療色素——竹紅菌甲素及多糖。其具有抗炎、鎮痛、抗菌、光敏殺傷腫瘤細胞等多種功能，在醫藥、食品及植物保護等領域有廣闊應用前景[2-6]。近年，又首次從竹黃菌中分離得到9個化合物，其中11，11-dideoxy verticillin A具有抗腫瘤活性[7]。新分離到的一個產漆酶菌株，經優化培養條件后，產漆酶酶活水平達120000U/L水平，與已報道的白腐真菌相比，具有發酵周期短且產漆酶酶活較高的優點[8]。特別值得一提的是，研究發現，竹黃菌不只是某些竹種的專性寄生菌。Zhu等[9]從蛇足石杉中分離到一株能產生石杉堿的內生竹黃菌分離體，Shiraiasp.SLf14。他們研究發現這株竹黃菌能產生具有增強記憶、改善記憶損傷和提高腦力活動效率等攻效的一種膽堿酯酶抑制劑——石杉堿。上述發現不僅提供了開辟生產石杉堿及漆酶的一種新選擇，同時也為竹黃菌資源的開發利用拓展了空間。由于竹黃及竹紅菌素應用研究成果的推動，在新菌株分離篩選[10-11]、分類及系統學[12-13]、生物學及遺傳學[14-15]、液體培養優化、竹紅菌素的提取[5，16-17]、原地保育人工接種及固體培養條件等方面的研究都有了新的進展。但是對保護竹黃自然資源和擴大利用范圍有重要價值的異地培育、成功獲得竹黃子座——子實體的實例則未見報道[18]。本文將報道作者在添加竹枝的固體培養基上，成功獲得類竹黃子實體結構的實驗結果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 竹黃菌Shiraia bambusicolaGZDXIFR-181菌株[10]，保存于貴州大學真菌資源研究所；短穗竹，竹紅菌甲素（純度98%） 南京康滿林公司。

紫外分光光度儀為752型 上海第三分析儀器廠；基因擴增與測序 上海鼎安生物科技有限公司。

1.2 菌株活化及產子實體實驗培養基的制備

1.2.1 斜面母種培養基 土豆200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然。

1.2.2 實驗用培養基配制

1.2.2.1 PDA培養基 土豆200g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標號A。

1.2.2.2 PDA培養基+竹枝 土豆200g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標號B。

1.2.2.3 大米玉米培養基+竹枝 大米150g，玉米粉50g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標號C。

1.2.2.4 大米玉米竹汁培養基+竹枝 大米140g，玉米粉40g，竹子20g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標號D。

1.2.2.5 竹汁培養基+竹枝 竹枝200g（煮沸取濾液），葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000m L，pH自然，標號E。

以上培養基配制好后，分別裝入高11cm、直徑7cm的玻璃瓶和500m L的三角瓶中，每瓶裝入100m L培養基。然后將剪切長度為8cm的竹枝，以一根稍粗的竹枝作為中心，用棉線捆綁成直徑約為2cm的竹枝束，插入除培養基A外的其余培養基中，1×105Pa滅菌30m in，備用。

1.3 接種培養及培養特征觀察

式中Tmax為當代進出庫序列中執行進出庫作業時間最大值。以其作為適應度參數，可以保證適應度函數最大的序列作業時間最小，同時淘汰作業集合中執行時間最長的序列。

培養基冷卻后，用接種針挑取少許已活化的菌種，接種在已滅菌的培養基中心，接種完成后用封口膜封好。置于26℃的恒溫箱培養。第7d描述并記錄菌絲生長及產竹紅菌素的情況。

1.4 生物量測定方法

培養7d后，用游標卡尺測量記載竹黃菌在不同培養基上的菌落直徑，觀察菌絲的生長情況。之后刮下培養基上的氣絲菌絲，置于已烘干恒重的紙片上，再一起放入50℃的干燥箱，24h后取出，溫度降至室溫（約20℃）后，于精密天平上稱重，記錄。

1.5 竹紅菌甲素標準曲線的制備

精確稱取竹紅菌甲素標準品10mg，置于10m L容量瓶中，用無水乙醇溶解、搖勻，并定容至刻度，得標準品溶液。用無水乙醇稀釋成10、20、50、100μg/m L系列濃度的標準品溶液。取系列標準品溶液各200μL，在紫外分光光度儀465nm下測定吸光度，并繪制標準曲線。

1.6 處理樣品竹紅菌甲素的提取及測定

參照杜文等方法進行[4]，按竹黃菌干重∶無水乙醇=10∶6（mg∶m L）的比例，浸提24h，3000r/min離心，取上清液，用紫外分光光度計于波長465nm測定吸光度，基于標準曲線查值并計算竹紅菌甲素的含量。

將待測材料按照Tigano-M ilani方法提取基因組DNA。對其ITS-5.8S區域采用ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）和ITS5（GGAAGTAAAA GT CG TAACAAGG）進行擴增和測序，將菌株測得的ITS序列于GenBank上進行BLAST比對，選擇相似性大于93%的菌株及其序列用CLUSTALX1.81作完全比對，經手工校正后，用Mega4.0軟件構建系統樹進行分子鑒定。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

通過回歸計算，其回歸方程為Y=0.1669X-0.0004（R2=0.9984），其中X為465nm下的吸光度，Y為竹紅菌甲素的含量（mg/m L），竹紅菌甲素的標準曲線見圖1。從圖1可見，此標準曲線線性關系較好。可用于本實驗的各項測定。

圖1 竹紅菌甲素的標準曲線Fig.1 Standard curve of hypocrellin A

2.2 竹黃無性型菌株的培養特征

在各培養基上培養7d，氣生菌絲呈絮狀或絨毛狀，呈白色（圖2）；培養10d后，菌落中央顏色變深，菌落天鵝絨狀，紅色素開始分泌，繼續培養菌落顏色由白色逐漸轉變成灰白色，菌落背面顏色變紅褐色。其中，E號培養基（竹汁+竹枝）不僅菌絲生長豐滿，且氣生菌絲肉紅色。

圖2 在不同培養基上竹黃菌的生長差異Fig.2 Growth differencesof Shiraiabambusicola on severalmedias

2.3 不同培養基對竹黃菌生長和產竹紅菌甲素的影響

不同培養基中竹枝對竹黃菌生物量和產竹紅菌甲素的影響結果見圖3。從圖3看出，在PDA（A）和竹汁+竹枝（E）兩種有植物液的培養基上，竹黃菌的生長速度、生物量和竹紅菌素的產量都較高。而在以大米玉米為基礎的碳源豐富的培養基上（C和D），即使加入竹枝誘導，其竹紅菌素的含量和重量都最低。這或許提供了啟示，植物浸出液中的其他生物活性物質對菌的生長和竹紅菌素的形成有重要作用。

圖3 不同培養基對竹黃菌生物量及產竹紅菌甲素的影響Fig.3 Effectof severalmedias on the biomass and hypocrellin A production of Shiraia bambusicola

2.4 不同培養基對竹黃菌子實體的影響

各種實驗用培養基經過6個月室溫（0～20℃）的培養，僅見E培養基中產生約7個/瓶的團塊狀類子實體結構（S.bambusicola-like fruit body）（圖4），灰白色，大小不同的類子實體的長寬范圍為6.9~11.5mm，切開后內部灰黑色。制片觀察未見產孢結構和孢子。采用前述方法測定竹紅菌素的含量為10.27mg/L。

圖4 人工培養基上的類竹黃子實體結構Fig.4 S.bambusicola-like fruitbody on an artificialmedium

將形成的子實體提取DNA和PCR擴增、測序，于GenBank上進行BLAST，下載相近序列和作者分離確定的GZDXIFR-181和GZDXIFR-171竹黃菌株序列建立系統發育樹（圖5）進行分子鑒定分析。從系統發育樹可清楚觀察到，人工培養的子實體與全部已知竹黃菌序列聚在一個進化分支中（支持率達99%）。分子證據有力驗證了人工培養產生的類竹黃子實體結構是培養接種竹黃菌的培養物。在以竹汁為基礎培養基上加入竹枝人工培養竹黃子實體獲得了明顯進展。

其次，B~E培養基都添加竹枝，只有培養基E中產生了該結構，其余均未見。因此從本實驗結果看出，添加竹枝未必是產生子實體的主要因素。而通過過濾煮沸的竹枝獲得的竹汁中，某些成分有可能刺激竹黃子實體的形成，有待進一步研究。

圖5 人工培養子實體與GenBank中已知竹黃菌ITS序列構建的Mp系統發育樹（Mega4.0）Fig.5 Phylogenetic tree（Mp）from Ac-fruitbody and GenBank sequences of Shiraia bambusicola（Mega.4.0）

3 結論與討論

林海萍[19]在含竹筍50%，棉籽殼25%，米糠20%，玉米粉1%，蔗糖1%，CaCO32%，MgSO40.25%，KH2PO40.5%培養基中，試管培養約35d后，菌絲變紅，長出原基，最后在培養料的頂部長出淺灰色的塊狀物，切片后見有分生孢子，但未檢測到竹紅菌素形成。而后再未見成功培養報道。因而假定子實體是否含有竹紅菌素成了一個重要的判別指標。但最新研究發現，一種常見的產黃青霉Penicillium chrysogenum Thom也能形成竹紅菌素[20]。因此，以形成竹紅菌素作為唯一判別指標也有失偏頗。作者在研究中應用了解剖觀察、竹紅菌素形成和分子鑒定相結合的多途徑方法更嚴謹地進行了考證。雖然解剖觀察未見孢子，但產竹紅菌素的結果和分子分析支持了作者培養獲得的類竹黃子實體結構或許是未成熟的竹黃子實體。

現有研究已表明，竹的主要成分（90%以上）是纖維素和木質素，其他是少量的水、有機抽提物和灰分[21]。在不同竹種間及同種的不同部位，它們的同一化學成分含量都不同，特別是各種抽提物和灰分變異更大[22]。作者培養基中所用的竹種非原產地被竹黃菌寄生的短穗竹，且培養基中營養成分也較為貧乏。這可能是未能獲得成熟子實體的原因之一。另一原因可能是由于長時間的培養而使培養基干燥，也阻礙了培養物的進一步生長發育。因此進一步的研究應考慮加富培養基和來自同一生境中共棲菌的應用。

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Artificial culture of the anamorph of Shiraia bambusicola

HAN Yan-feng，DUW en，LIANG Jian-dong，LIANG Zong-Qi*
（Institute of Fungus Resources，College of Life Science，Guizhou University，Guiyang 550025，China）

The biomass，hypoc rellin A and form ing fruitbody of Shiraia bambusicola on the d ifferentmed ias were exp lored.Through the method of culture characters，hypoc rellin A determ ination and molecular biology，the results showed thatm ycielia biomass and hypocrellin A were the best on the med ium consisting of g lucose 20g，agar 20g，bamboo filter liquor（bamboo pole 200g boiled）1000m L，and inserted sterile bumboo poles；And on above medium，S.bambusicola-like fruit bod ies were ob tained when the strain were inoculated and cultivated under the room temperature（0～20℃）lasting six months.S.bambusicola-like fruit bodies were confirmed by hypoc rellin A determ ination and molecular identification.The experiments showed that the fruit body of S.bambusicola on artificial culture made p rog ress.

Shiraia bambusicola；fruitbody；artificial culture；hypocrellin a；molecular identification

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0239-04

2012－02－20 *通訊聯系人

韓燕峰（1978－），女，博士，副教授，主要從事真菌資源及其利用方面的研究。

國家自然科學基金項目（30960004）；貴州省自然科學基金項目[黔科合字（2008）2266號]；貴州大學引進人才科研項目[貴大人基合字（2007）035號]。