微生物發(fā)酵法制取大豆油脂及發(fā)酵條件優(yōu)化

于 妍，張 智，王 楠，王 雷

（東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

微生物發(fā)酵法制取大豆油脂及發(fā)酵條件優(yōu)化

于 妍，張 智*，王 楠，王 雷

（東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040）

用微生物發(fā)酵法提取低油料作物大豆中的油脂，并在單因素實驗的基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面分析法對微生物發(fā)酵法提取大豆油的影響因素進行分析，結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為底物濃度10%、粉碎程度過80目篩、溫度36.4℃、pH4.62、培養(yǎng)時間19.14h。此條件下每10g大豆可得油0.524g。

微生物，發(fā)酵，大豆油脂，響應(yīng)面分析法

大豆油脂取自大豆種子，是一種營養(yǎng)價值很高的優(yōu)良食用油[1]。大豆油中含棕櫚酸7%~10%，硬脂酸2%~5%，花生酸1%~3%，油酸22%~30%，亞油酸50% ~60%，亞麻油酸5%~9%，脂肪酸的構(gòu)成好，可以顯著地降低血清膽固醇含量，能起到預(yù)防心血管疾病的功效[2-3]。大豆油中還含有多量的維生素D、維生素E以及豐富的卵磷脂，對人體神經(jīng)血管大腦的生長發(fā)育非常有益[3]。豆油在人體的消化吸收率高達98%[4]，不含致癌物質(zhì)和膽固醇，對機體有一定的保護作用。不僅如此，豆油具有驅(qū)蟲、潤腸的作用，涂抹可治療多種瘡疥、毒瘀等。工業(yè)上大豆油可用于制造油漆、油墨、高級潤滑油、人造奶油、人造羊毛、人造纖維的原料以及醫(yī)藥上的補養(yǎng)藥品。大豆油還有防腐性能，可作桐油、亞麻油的代用品。傳統(tǒng)制油工藝一般采取壓榨法和浸出法制取大豆油。產(chǎn)油率雖高，但加工過程中大豆本身的營養(yǎng)價值卻遭到了破壞，油脂提取后的大豆粕大部分用于做飼料，潛在價值并未得到充分的利用，加工附加值較低，造成了巨大的資源浪費。因此，研究新的大豆油脂提取加工技術(shù)和理論以及高值化利用該下腳料資源是非常有意義的[5-7]。發(fā)酵技術(shù)是指人們利用微生物的發(fā)酵作用，運用一些技術(shù)手段控制發(fā)酵過程，大規(guī)模生產(chǎn)發(fā)酵產(chǎn)品的技術(shù)。其內(nèi)容包括菌種的選育、培養(yǎng)基的配制、擴大培養(yǎng)及接種和產(chǎn)品分離提純等方面。大豆中的主要成分是大豆油脂和大豆蛋白，且兩者是結(jié)合在一起的[8]，因此，利用產(chǎn)酶菌種在發(fā)酵過程中可以產(chǎn)生大量種類豐富的酶這一特點，應(yīng)用微生物發(fā)酵技術(shù)分離大豆油脂和大豆蛋白是可行的[5]。利用微生物發(fā)酵法提取大豆油，具有成本低廉，工藝簡單，條件溫和，營養(yǎng)價值損失小等特點，在發(fā)酵過程中，菌種生長和產(chǎn)酶同時進行，制取的大豆油中不飽和脂肪酸、亞油酸等有益成分含量較高，品質(zhì)符合食用油的國家標準。同時，在對大豆粕進行其他方法的進一步提油后，再進行簡單處理就可得到高質(zhì)量富含小肽的大豆蛋白副產(chǎn)品[9-12]。本文用微生物法提取大豆油并考察發(fā)酵過程中底物濃度、原料破碎程度、初始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對油脂提取量的影響，應(yīng)用響應(yīng)面分析法，以提油量作為響應(yīng)值，對影響微生物法提油的幾個因素進行優(yōu)化，確定微生物發(fā)酵法提取大豆油脂的工藝條件。目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售，購于黑龍江；天然豆粉 市售，黑龍江大豆經(jīng)萬能粉碎機粉碎；枯草芽孢桿菌（Bacillus vallismortis；B9） 東北林業(yè)大學(xué)實驗室保存，是經(jīng)過選育篩選出來的可產(chǎn)蛋白酶的性能穩(wěn)定菌株；斜面培養(yǎng)基 硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、瓊脂2%、玉米糖化液97.85%，調(diào)垂度至10左右；搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基 天然大豆粉10%，水90%；乙醚、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、鹽酸 分析純，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

ALC-310.3電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；5030-PVL高壓滅菌鍋、電熱恒溫水浴鍋（0~100℃）、DH 6000A電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-X100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東明醫(yī)療器械廠；FW 100高速萬能粉碎機 蘇州江東精密儀器有限公司；PHS-25 pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵后發(fā)酵液中的游離大豆油含量的測定[13]乙醚萃取后用差重法算出大豆油的得量。

1.2.2 發(fā)酵條件篩選實驗

1.2.2.1 底物濃度對微生物法分離大豆油的影響將大豆洗凈晾干后粉碎并過80目篩，用天然大豆粉和水配成濃度為6%、7%、8%、9%、10%的發(fā)酵培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基的pH調(diào)至5，120℃30min條件下對培養(yǎng)基進行滅菌，按接種量10%接入菌種，36℃恒溫搖床培養(yǎng)19h，按照1.2.1的方法測定發(fā)酵過程產(chǎn)生的游離大豆油的含量，并以提油量多少作為評價指標進行底物濃度實驗。

1.2.2.2 原料粉碎程度的影響 將大豆進行粉碎，分別過20、40、60、80、100目篩，稱取10g大豆粉，加水配成10%的培養(yǎng)基，在pH 5，溫度36℃條件下?lián)u床培養(yǎng)19h，測提油量。

1.2.2.3 初始pH的影響 將大豆粉碎后過80目篩，稱取10g大豆粉，配成濃度為10%的天然培養(yǎng)基，并將培養(yǎng)基的pH分別調(diào)至1、3、5、7、9、11六個水平，36℃恒溫搖床培養(yǎng)19h，測提油量。

1.2.2.4 培養(yǎng)溫度的影響 將大豆粉碎后過80目篩，稱取10g大豆粉加水配成濃度為10%的培養(yǎng)基，pH調(diào)至5，溫度分別設(shè)定為32、34、36、38、40℃，搖床培養(yǎng)19h，測提油量。

1.2.2.5 發(fā)酵時間的影響 將大豆粉碎后過80目篩，稱取10g大豆粉加水配成濃度為10%的培養(yǎng)基，在pH 5，溫度36℃條件下?lián)u床培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別設(shè)定為16、19、22、25、28h，測提油量。

1.2.3 響應(yīng)曲面設(shè)計實驗 根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選擇發(fā)酵時間、pH和培養(yǎng)溫度三個因素作為響應(yīng)變量，利用M initab軟件按照Box-Behnken原理進行響應(yīng)面設(shè)計，優(yōu)化微生物發(fā)酵法提取大豆油脂的工藝。各實驗組的編碼與取值見表1，共15個實驗點，其中12個為析因點，3個為零點，零點實驗進行三次，作誤差估計。

表1 實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 底物濃度對提油量的影響

圖1 底物濃度對提油量的影響Fig.1 Effectof substrate concentration on extracting the oil from soybean

由圖1可知，底物濃度對測定結(jié)果有較大影響，底物濃度從6%起升高到10%過程中，提油量隨之提高，增加趨勢明顯。但考慮到底物濃度過高時，天然大豆培養(yǎng)基會因為糊狀粘度過大而變成固態(tài)或半固態(tài)，基質(zhì)中水分含量低，不利于微生物所產(chǎn)的蛋白酶對于大豆蛋白的水解作用，而且在36℃下?lián)u床培養(yǎng)19h過程中培養(yǎng)基中的一部分水分還會由于蒸發(fā)而喪失，因此，本實驗的底物濃度不宜超過10%，且底物濃度也不宜被選作響應(yīng)面分析中的一個條件繼續(xù)分析，綜合考慮確定微生物發(fā)酵法提大豆油的培養(yǎng)基底物濃度應(yīng)為10%。

2.2 原料粉碎程度對提油量的影響

圖2 原料粉碎程度對提油量的影響Fig.2 Effectof degree of grinding on extracting the oil from soybean

由圖2可知，原料粉碎程度對發(fā)酵效果有一定影響，原料粉碎程度越高提油效果越好，但是在實際生產(chǎn)過程中很難做到將原料粉碎的特別細，過細的原料粉碎程度要求，在實際生產(chǎn)過程中會大大提高生產(chǎn)成本。綜合考慮確定將過80目篩作為粉碎的標準，并且原料粉碎程度也不宜作為本實驗中響應(yīng)面分析的條件。

2.3 pH對提油量的影響

由圖3可知，菌株所產(chǎn)蛋白酶對大豆粉的酶解效果與發(fā)酵的初始pH密切相關(guān)，同時，pH也會影響菌種的產(chǎn)酶量，進而影響大豆的提油量。pH在1~3之間時，提油量隨pH升高顯著提高，在3~5之間提油量隨pH升高而提高的趨勢開始變緩，pH再提高時，提油量則逐漸減少，所以選擇pH 5為發(fā)酵的初始pH，說明該菌產(chǎn)蛋白酶的最適pH偏酸性。

圖3 pH對提油量的影響Fig.3 Effectof pH on extracting the oil from soybean

2.4 培養(yǎng)溫度對提油量的影響

圖4 溫度對提油量的影響Fig.4 Effect of temperature on extracting the oil from soybean

由圖4可知，溫度也是一個微生物法提油過程中的關(guān)鍵因素，過高或過低的溫度都有可能影響微生物產(chǎn)酶和酶的作用效果，溫度從32℃變化到36℃提油量不斷增加，且增加的趨勢明顯。溫度升至36~40℃，提油量開始下降，下降原因，一方面是由于一部分菌種在高溫時已經(jīng)失活或死亡；一方面是由于微生物所產(chǎn)的蛋白酶耐熱性不強，變性失活。綜合考慮確定以36℃作為最佳發(fā)酵溫度。

2.5 發(fā)酵時間對提油量的影響

圖5 時間對提油量的影響Fig.5 Effectof time on extracting the oil from soybean

由圖5可知，發(fā)酵時間對微生物法提油過程有一定影響，發(fā)酵時間過長或過短都會導(dǎo)致產(chǎn)油量較低的現(xiàn)象產(chǎn)生，發(fā)酵時間在16~19h時提油率在增長，說明這時的菌體數(shù)在不斷地積累，菌株產(chǎn)酶量不斷增加；發(fā)酵時間在19~28h時，菌體生長進入穩(wěn)定和衰亡期，所產(chǎn)酶的酶活也開始下降。因此，將19h作為最佳發(fā)酵時間。

2.6 響應(yīng)面設(shè)計實驗結(jié)果分析[14-16]

2.6.1 響應(yīng)面設(shè)計實驗結(jié)果 如表2所示，實驗點共有15個。可分為兩類：一是12個析因點；二是零點，為區(qū)域的中心點。零點實驗重復(fù)3次，以估計誤差。

運用Minitab15數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件使用未編碼單位對實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗結(jié)果見表3，得到時間、pH、溫度的二次多項回歸模型：Y=0.559+0.004125A－0.030125B+0.01525C－0.1115A2－0.1375B2－0.1448C2－0.009AB－0.01725AC+ 0.00725BC

表2 Box-behnken實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 The design and results of Box-behnken experiment

表3 回歸方程偏回歸系數(shù)的估計值Table 3 Estimate of regression coefficient

回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗結(jié)果殘差的平方和為99.67%，說明此模型與數(shù)據(jù)擬合度很高。從表3回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果中可以看出，模型的一次項B和C顯著，其中C（培養(yǎng)溫度）影響程度最為顯著，其次為B（pH）；二次項B2、C2影響極顯著，A2影響顯著，其他各項不顯著。由此可知，各影響因素對于提油量的影響不是簡單的線性關(guān)系。

進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，相應(yīng)數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果見表4，校正決定系數(shù)R2Adj=99.08%，p=0.000＜0.001，回歸模型極顯著，失擬項p=0.027＞0.01，說明模型擬合度良好，可用此模型來分析和預(yù)測微生物法提取大豆油脂的提取量。

2.6.2 各因素交互作用的響應(yīng)面圖 根據(jù)回歸方程作出模型的響應(yīng)曲面及其等高線見圖6～圖8，三組圖直觀的反映了各個因素對響應(yīng)值的影響。由圖6可知，培養(yǎng)溫度為36℃條件下，初始pH在4.5~5.0，發(fā)酵時間19~19.5h范圍內(nèi)，提油量達到極值。初始pH與發(fā)酵時間兩個因素之間的相互作用不顯著。由圖7可知，初始pH 5時，培養(yǎng)溫度36~36.5℃，發(fā)酵時間19~ 19.5h范圍內(nèi)提油量達到極值。初始pH與培養(yǎng)溫度兩個因素之間的相互作用最為顯著。由圖8可知發(fā)酵時間固定在19h不變情況下，培養(yǎng)溫度36~36.5℃，初始pH在4.5~5.0范圍內(nèi)，提油量達到極值。說明培養(yǎng)溫度與初始pH兩個因素之間的相互作用較為顯著。

由圖6~圖8可以看出，各因素對大豆提油量均有不同程度影響，大豆提油率在實驗區(qū)內(nèi)可達到極值。分別對回歸方程中的A、B、C求偏導(dǎo)，并令其為零，可得到模型的最優(yōu)解：A=0.04819、B=-0.1895、C=0.2189，在此條件下（發(fā)酵時間為19.14h、初始pH為4.62、培養(yǎng)溫度為36.4℃）響應(yīng)面理論預(yù)測的提油量為0.526g（10g底物）。

2.6.3 驗證實驗 按以上對M initab軟件所得優(yōu)化響應(yīng)值，即在可操作的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)條件下進行三個平行實驗，最后實驗提油量為0.524g，提油量的實際值與預(yù)測值之間的誤差為0.002g，由此可說明通過響應(yīng)面優(yōu)化的發(fā)酵條件是合理的。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression

圖6 初始pH和發(fā)酵時間對提油量影響的響應(yīng)面Fig.6 Response surface about the effect of pH and time on extracting the oil from soybean

3 結(jié)論

圖7 培養(yǎng)溫度和發(fā)酵時間對提油量的響應(yīng)面Fig.7 Response surface about the effectof temperature and time on extracting the oil from soybean

本研究利用M initab軟件對發(fā)酵條件進行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計，發(fā)現(xiàn)此方法具有良好的應(yīng)用性和預(yù)測性，能提供較準確的變量和誤差信息。

采用M initab軟件對微生物發(fā)酵條件進行了響應(yīng)面優(yōu)化，擬合了各因素對于微生物發(fā)酵法提取大豆油的回歸方程：Y=0.559+0.004125A－0.030125B+ 0.01525C－0.1115A2－0.1375B2－0.1448C2－0.009AB－0.01725AC+0.00725BC確定了影響微生物法提油的因素的顯著性為培養(yǎng)溫度＞初始pH＞發(fā)酵時間，在對各顯著因素作用進行探討后，得到的優(yōu)化工藝參數(shù)為：發(fā)酵培養(yǎng)溫度36.4℃、pH 4.62、培養(yǎng)時間19.14h。在此條件下，可得提取量0.524g大豆油（10g大豆）。因此，利用響應(yīng)面分析方法對微生物發(fā)酵法提取大豆油脂工藝進行優(yōu)化，可以得到最優(yōu)發(fā)酵工藝參數(shù)，從而為下一步實驗研究奠定基礎(chǔ)。

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Production of soybean oilby m icrobial fermentation and optim ization of fermentation production conditions

YU Yan，ZHANG Zhi*，WANG Nan，WANG Lei
（School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

The oil content of the soybean was very low.Microbial fermentation was used to extrac t the oil from soybean.And on the basis ofsing le-factor test，response surfacemethodology was used to analyzemain factors affecting the p roduction of soybean oil by m icrobial fermentation.Results showed that the op timal fermentation cond itions were as follows：substrate concentration 10%，deg ree of g rind ing should could pass through the 80 mesh fineness，36.4℃，pH4.62，19.14h，the output of soybean oil can reach to 0.524g from 10g soybean.

m ic roorganism；fermentation；soybean oil；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0231-05

2011－09－19 *通訊聯(lián)系人

于妍（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。