微生物發酵法制取大豆油脂及發酵條件優化

于 妍，張 智，王 楠，王 雷

（東北林業大學，黑龍江哈爾濱 150040）

微生物發酵法制取大豆油脂及發酵條件優化

于 妍，張 智*，王 楠，王 雷

（東北林業大學，黑龍江哈爾濱 150040）

用微生物發酵法提取低油料作物大豆中的油脂，并在單因素實驗的基礎上，應用響應面分析法對微生物發酵法提取大豆油的影響因素進行分析，結果表明，最佳發酵條件為底物濃度10%、粉碎程度過80目篩、溫度36.4℃、pH4.62、培養時間19.14h。此條件下每10g大豆可得油0.524g。

微生物，發酵，大豆油脂，響應面分析法

大豆油脂取自大豆種子，是一種營養價值很高的優良食用油[1]。大豆油中含棕櫚酸7%~10%，硬脂酸2%~5%，花生酸1%~3%，油酸22%~30%，亞油酸50% ~60%，亞麻油酸5%~9%，脂肪酸的構成好，可以顯著地降低血清膽固醇含量，能起到預防心血管疾病的功效[2-3]。大豆油中還含有多量的維生素D、維生素E以及豐富的卵磷脂，對人體神經血管大腦的生長發育非常有益[3]。豆油在人體的消化吸收率高達98%[4]，不含致癌物質和膽固醇，對機體有一定的保護作用。不僅如此，豆油具有驅蟲、潤腸的作用，涂抹可治療多種瘡疥、毒瘀等。工業上大豆油可用于制造油漆、油墨、高級潤滑油、人造奶油、人造羊毛、人造纖維的原料以及醫藥上的補養藥品。大豆油還有防腐性能，可作桐油、亞麻油的代用品。傳統制油工藝一般采取壓榨法和浸出法制取大豆油。產油率雖高，但加工過程中大豆本身的營養價值卻遭到了破壞，油脂提取后的大豆粕大部分用于做飼料，潛在價值并未得到充分的利用，加工附加值較低，造成了巨大的資源浪費。因此，研究新的大豆油脂提取加工技術和理論以及高值化利用該下腳料資源是非常有意義的[5-7]。發酵技術是指人們利用微生物的發酵作用，運用一些技術手段控制發酵過程，大規模生產發酵產品的技術。其內容包括菌種的選育、培養基的配制、擴大培養及接種和產品分離提純等方面。大豆中的主要成分是大豆油脂和大豆蛋白，且兩者是結合在一起的[8]，因此，利用產酶菌種在發酵過程中可以產生大量種類豐富的酶這一特點，應用微生物發酵技術分離大豆油脂和大豆蛋白是可行的[5]。利用微生物發酵法提取大豆油，具有成本低廉，工藝簡單，條件溫和，營養價值損失小等特點，在發酵過程中，菌種生長和產酶同時進行，制取的大豆油中不飽和脂肪酸、亞油酸等有益成分含量較高，品質符合食用油的國家標準。同時，在對大豆粕進行其他方法的進一步提油后，再進行簡單處理就可得到高質量富含小肽的大豆蛋白副產品[9-12]。本文用微生物法提取大豆油并考察發酵過程中底物濃度、原料破碎程度、初始pH、發酵溫度、發酵時間對油脂提取量的影響，應用響應面分析法，以提油量作為響應值，對影響微生物法提油的幾個因素進行優化，確定微生物發酵法提取大豆油脂的工藝條件。目前國內外尚未見相關報道。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 市售，購于黑龍江；天然豆粉 市售，黑龍江大豆經萬能粉碎機粉碎；枯草芽孢桿菌（Bacillus vallismortis；B9） 東北林業大學實驗室保存，是經過選育篩選出來的可產蛋白酶的性能穩定菌株；斜面培養基 硫酸鎂0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、瓊脂2%、玉米糖化液97.85%，調垂度至10左右；搖瓶發酵培養基 天然大豆粉10%，水90%；乙醚、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、鹽酸 分析純，天津市天力化學試劑有限公司。

ALC-310.3電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；5030-PVL高壓滅菌鍋、電熱恒溫水浴鍋（0~100℃）、DH 6000A電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；HZQ-X100振蕩培養箱 哈爾濱市東明醫療器械廠；FW 100高速萬能粉碎機 蘇州江東精密儀器有限公司；PHS-25 pH計 上海雷磁儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵后發酵液中的游離大豆油含量的測定[13]乙醚萃取后用差重法算出大豆油的得量。

1.2.2 發酵條件篩選實驗

1.2.2.1 底物濃度對微生物法分離大豆油的影響將大豆洗凈晾干后粉碎并過80目篩，用天然大豆粉和水配成濃度為6%、7%、8%、9%、10%的發酵培養基，并將培養基的pH調至5，120℃30min條件下對培養基進行滅菌，按接種量10%接入菌種，36℃恒溫搖床培養19h，按照1.2.1的方法測定發酵過程產生的游離大豆油的含量，并以提油量多少作為評價指標進行底物濃度實驗。

1.2.2.2 原料粉碎程度的影響 將大豆進行粉碎，分別過20、40、60、80、100目篩，稱取10g大豆粉，加水配成10%的培養基，在pH 5，溫度36℃條件下搖床培養19h，測提油量。

1.2.2.3 初始pH的影響 將大豆粉碎后過80目篩，稱取10g大豆粉，配成濃度為10%的天然培養基，并將培養基的pH分別調至1、3、5、7、9、11六個水平，36℃恒溫搖床培養19h，測提油量。

1.2.2.4 培養溫度的影響 將大豆粉碎后過80目篩，稱取10g大豆粉加水配成濃度為10%的培養基，pH調至5，溫度分別設定為32、34、36、38、40℃，搖床培養19h，測提油量。

1.2.2.5 發酵時間的影響 將大豆粉碎后過80目篩，稱取10g大豆粉加水配成濃度為10%的培養基，在pH 5，溫度36℃條件下搖床培養，培養時間分別設定為16、19、22、25、28h，測提油量。

1.2.3 響應曲面設計實驗 根據單因素實驗結果，選擇發酵時間、pH和培養溫度三個因素作為響應變量，利用M initab軟件按照Box-Behnken原理進行響應面設計，優化微生物發酵法提取大豆油脂的工藝。各實驗組的編碼與取值見表1，共15個實驗點，其中12個為析因點，3個為零點，零點實驗進行三次，作誤差估計。

表1 實驗因素水平表Table 1 The factors and levels of experiment

2 結果與分析

2.1 底物濃度對提油量的影響

圖1 底物濃度對提油量的影響Fig.1 Effectof substrate concentration on extracting the oil from soybean

由圖1可知，底物濃度對測定結果有較大影響，底物濃度從6%起升高到10%過程中，提油量隨之提高，增加趨勢明顯。但考慮到底物濃度過高時，天然大豆培養基會因為糊狀粘度過大而變成固態或半固態，基質中水分含量低，不利于微生物所產的蛋白酶對于大豆蛋白的水解作用，而且在36℃下搖床培養19h過程中培養基中的一部分水分還會由于蒸發而喪失，因此，本實驗的底物濃度不宜超過10%，且底物濃度也不宜被選作響應面分析中的一個條件繼續分析，綜合考慮確定微生物發酵法提大豆油的培養基底物濃度應為10%。

2.2 原料粉碎程度對提油量的影響

圖2 原料粉碎程度對提油量的影響Fig.2 Effectof degree of grinding on extracting the oil from soybean

由圖2可知，原料粉碎程度對發酵效果有一定影響，原料粉碎程度越高提油效果越好，但是在實際生產過程中很難做到將原料粉碎的特別細，過細的原料粉碎程度要求，在實際生產過程中會大大提高生產成本。綜合考慮確定將過80目篩作為粉碎的標準，并且原料粉碎程度也不宜作為本實驗中響應面分析的條件。

2.3 pH對提油量的影響

由圖3可知，菌株所產蛋白酶對大豆粉的酶解效果與發酵的初始pH密切相關，同時，pH也會影響菌種的產酶量，進而影響大豆的提油量。pH在1~3之間時，提油量隨pH升高顯著提高，在3~5之間提油量隨pH升高而提高的趨勢開始變緩，pH再提高時，提油量則逐漸減少，所以選擇pH 5為發酵的初始pH，說明該菌產蛋白酶的最適pH偏酸性。

圖3 pH對提油量的影響Fig.3 Effectof pH on extracting the oil from soybean

2.4 培養溫度對提油量的影響

圖4 溫度對提油量的影響Fig.4 Effect of temperature on extracting the oil from soybean

由圖4可知，溫度也是一個微生物法提油過程中的關鍵因素，過高或過低的溫度都有可能影響微生物產酶和酶的作用效果，溫度從32℃變化到36℃提油量不斷增加，且增加的趨勢明顯。溫度升至36~40℃，提油量開始下降，下降原因，一方面是由于一部分菌種在高溫時已經失活或死亡；一方面是由于微生物所產的蛋白酶耐熱性不強，變性失活。綜合考慮確定以36℃作為最佳發酵溫度。

2.5 發酵時間對提油量的影響

圖5 時間對提油量的影響Fig.5 Effectof time on extracting the oil from soybean

由圖5可知，發酵時間對微生物法提油過程有一定影響，發酵時間過長或過短都會導致產油量較低的現象產生，發酵時間在16~19h時提油率在增長，說明這時的菌體數在不斷地積累，菌株產酶量不斷增加；發酵時間在19~28h時，菌體生長進入穩定和衰亡期，所產酶的酶活也開始下降。因此，將19h作為最佳發酵時間。

2.6 響應面設計實驗結果分析[14-16]

2.6.1 響應面設計實驗結果 如表2所示，實驗點共有15個。可分為兩類：一是12個析因點；二是零點，為區域的中心點。零點實驗重復3次，以估計誤差。

運用Minitab15數據統計分析軟件使用未編碼單位對實驗數據進行多元回歸擬合，回歸模型系數及顯著性檢驗結果見表3，得到時間、pH、溫度的二次多項回歸模型：Y=0.559+0.004125A－0.030125B+0.01525C－0.1115A2－0.1375B2－0.1448C2－0.009AB－0.01725AC+ 0.00725BC

表2 Box-behnken實驗設計及結果Table 2 The design and results of Box-behnken experiment

表3 回歸方程偏回歸系數的估計值Table 3 Estimate of regression coefficient

回歸模型系數的顯著性檢驗結果殘差的平方和為99.67%，說明此模型與數據擬合度很高。從表3回歸模型系數顯著性檢驗結果中可以看出，模型的一次項B和C顯著，其中C（培養溫度）影響程度最為顯著，其次為B（pH）；二次項B2、C2影響極顯著，A2影響顯著，其他各項不顯著。由此可知，各影響因素對于提油量的影響不是簡單的線性關系。

進一步對該回歸模型進行顯著性檢驗，相應數據的方差分析結果見表4，校正決定系數R2Adj=99.08%，p=0.000＜0.001，回歸模型極顯著，失擬項p=0.027＞0.01，說明模型擬合度良好，可用此模型來分析和預測微生物法提取大豆油脂的提取量。

2.6.2 各因素交互作用的響應面圖 根據回歸方程作出模型的響應曲面及其等高線見圖6～圖8，三組圖直觀的反映了各個因素對響應值的影響。由圖6可知，培養溫度為36℃條件下，初始pH在4.5~5.0，發酵時間19~19.5h范圍內，提油量達到極值。初始pH與發酵時間兩個因素之間的相互作用不顯著。由圖7可知，初始pH 5時，培養溫度36~36.5℃，發酵時間19~ 19.5h范圍內提油量達到極值。初始pH與培養溫度兩個因素之間的相互作用最為顯著。由圖8可知發酵時間固定在19h不變情況下，培養溫度36~36.5℃，初始pH在4.5~5.0范圍內，提油量達到極值。說明培養溫度與初始pH兩個因素之間的相互作用較為顯著。

由圖6~圖8可以看出，各因素對大豆提油量均有不同程度影響，大豆提油率在實驗區內可達到極值。分別對回歸方程中的A、B、C求偏導，并令其為零，可得到模型的最優解：A=0.04819、B=-0.1895、C=0.2189，在此條件下（發酵時間為19.14h、初始pH為4.62、培養溫度為36.4℃）響應面理論預測的提油量為0.526g（10g底物）。

2.6.3 驗證實驗 按以上對M initab軟件所得優化響應值，即在可操作的最優發酵參數條件下進行三個平行實驗，最后實驗提油量為0.524g，提油量的實際值與預測值之間的誤差為0.002g，由此可說明通過響應面優化的發酵條件是合理的。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance in regression

圖6 初始pH和發酵時間對提油量影響的響應面Fig.6 Response surface about the effect of pH and time on extracting the oil from soybean

3 結論

圖7 培養溫度和發酵時間對提油量的響應面Fig.7 Response surface about the effectof temperature and time on extracting the oil from soybean

本研究利用M initab軟件對發酵條件進行響應面優化設計，發現此方法具有良好的應用性和預測性，能提供較準確的變量和誤差信息。

采用M initab軟件對微生物發酵條件進行了響應面優化，擬合了各因素對于微生物發酵法提取大豆油的回歸方程：Y=0.559+0.004125A－0.030125B+ 0.01525C－0.1115A2－0.1375B2－0.1448C2－0.009AB－0.01725AC+0.00725BC確定了影響微生物法提油的因素的顯著性為培養溫度＞初始pH＞發酵時間，在對各顯著因素作用進行探討后，得到的優化工藝參數為：發酵培養溫度36.4℃、pH 4.62、培養時間19.14h。在此條件下，可得提取量0.524g大豆油（10g大豆）。因此，利用響應面分析方法對微生物發酵法提取大豆油脂工藝進行優化，可以得到最優發酵工藝參數，從而為下一步實驗研究奠定基礎。

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Production of soybean oilby m icrobial fermentation and optim ization of fermentation production conditions

YU Yan，ZHANG Zhi*，WANG Nan，WANG Lei
（School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China）

The oil content of the soybean was very low.Microbial fermentation was used to extrac t the oil from soybean.And on the basis ofsing le-factor test，response surfacemethodology was used to analyzemain factors affecting the p roduction of soybean oil by m icrobial fermentation.Results showed that the op timal fermentation cond itions were as follows：substrate concentration 10%，deg ree of g rind ing should could pass through the 80 mesh fineness，36.4℃，pH4.62，19.14h，the output of soybean oil can reach to 0.524g from 10g soybean.

m ic roorganism；fermentation；soybean oil；response surface methodology

TS201.3

A

1002-0306（2012）14-0231-05

2011－09－19 *通訊聯系人

于妍（1986-），女，碩士研究生，研究方向：食品生物技術。