酸奶中長雙歧桿菌PCR計數方法的建立

張紅發，任 婧，劉 景，游春蘋，顧瑾麟

（1.光明乳業股份有限公司技術中心，乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436；2.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

酸奶中長雙歧桿菌PCR計數方法的建立

張紅發1，2，任 婧1，劉 景1，游春蘋1，顧瑾麟1

（1.光明乳業股份有限公司技術中心，乳業生物技術國家重點實驗室，上海 200436；2.江南大學食品學院，食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇無錫 214122）

根據細菌保守序列設計一對通用引物，擴增細菌16S rDNA序列，作為陽性標記；根據長雙歧桿菌菌株的16S rRNA和23S rRNA之間的間區基因序列設計定性PCR引物。用BBL瓊脂平板對長雙歧桿菌混合發酵的酸奶進行培養計數，隨機挑選部分長出的菌落，提取DNA做PCR鑒定。將PCR技術與傳統平板計數技術結合起來，初步建立酸奶中長雙歧桿活菌計數方法。抽提方法操作簡便、高效、靈敏，決定著PCR計數方法的準確高效，本研究著重研究了菌體DNA抽提方法的影響因素，以及抽提方法通用性，同時也研究了PCR引物的特異性。將PCR技術與傳統平板計數技術結合起來，初步建立酸奶中長雙歧桿活菌計數方法。

PCR，計數，長雙歧桿菌

雙歧桿菌為存在人類腸道中益生菌，近年來國內外含雙歧桿菌活菌混和制劑日益增多特別是含雙歧桿菌和乳酸菌混合發酵的奶類制品[1]。產品中活菌數決定著產品質量，準確、快速的雙歧桿菌活菌計數方法越來越重要。而GB/T4789-34-2008《食品衛生微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗》中對雙歧桿菌采用生化反應和酶活測定鑒定，操作復雜，周期長，費用高，實際操作困難。傳統的細菌學檢驗與鑒定的主要依據是形態和生理特征，需要進行細菌培養和一系列生化反應檢測，方法復雜費時[2]；而PCR技術具有高度的特異性和敏感性[3]，打開了細菌快速鑒定的大門[4]。其不僅操作簡便、快速可靠并且靈敏、高效，還克服了對培養的依賴性[5]。隨著基因技術和網絡信息技術的發展，一般細菌的基因序列在網上都可以免費方便地查到；國內微生物基因測序公司也有很多，測序結果也很準確、方便、便宜，設計微生物種、屬甚至菌株特異性PCR引物變得容易、經濟。但PCR難以區分樣品中微生物的死活，計數樣品中的活菌需要與傳統培養計數方法相結合。為了初步建立酸奶中長雙歧桿菌PCR計數方法，研究了菌體DNA抽提方法的影響因素，以及抽提方法通用性。加熱煮沸法操作簡單，可以破壞G+細胞壁，使基因組DNA釋放出來，雖然有部分DNA可能被破壞降解，但仍能夠滿足PCR要求[6]。培養基也含有污染微生物的核酸[7]，若抽提方法過于靈敏，難以排除污染干擾。抽提方法要求操作簡便、高效，同時可以克服培養基中污染基因物質干擾。根據長雙歧桿菌菌株的16S rRNA和23S rRNA之間的間區基因序列設計定性PCR引物，研究了引物的特異性。結合具體實例，用BBL瓊脂平板對長雙歧桿菌混合發酵的酸奶進行培養計數，再PCR計數鑒定，最后計算出長雙歧桿菌活菌數。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

短雙歧桿菌（Bifidobacterium breve）、青春雙歧桿菌（Bifidobacterium adolescentis）、動物雙歧桿菌（Bifidobacteriumanimalis）、 兩 岐 雙 岐 桿 菌（Bifidobacterium bifidum）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus） 丹麥Dansico提供；長雙歧桿菌BL-1（Bifidobacterium longum） 光明乳業技術中心篩選并保藏；生鮮乳 采自上海第九牧場；BBL瓊脂培養基 上海滬峰生化試劑有限公司；半胱氨酸 分析純，國藥集團化學試劑有限公司；Taq DNA聚合酶、W ide Range DNA Marker TaKaRa公司。

Bugbox厭氧培養箱 英國Ruskinn Technology Limited公司；Veriti Thermal Cycler 96-well PCR儀美國App lied Biosystems公司；Type A2/Class II生物安全柜 美國Labconco公司；5424R小型臺式高速冷凍離心機 德國eppendorf公司；Leica DM 4000M顯微鏡

德國Leica公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體DNA提取效果檢驗PCR 選取培養平板上的單菌落，用10μL滅菌槍頭吸取菌體1μL，懸浮于20μL提取液（20mmol/L Tris/HCl，pH8.3）中。在研究菌體吸取量對PCR影響時，用去離子水做梯度稀釋。抽提方法采取煮沸法，具體操作參考文獻[8-9]。煮沸后的混合物直接作為PCR模板，用細菌16S rRNA通用引物：上游引物325F（5’-TCC TAC GGG AGG CAG CA-3’）和下游引物1367R（5’-CGG GCG GTG TGT ACA A-3’），做PCR，檢驗抽提效果。PCR產物長度為1000bp左右，所采用的PCR擴增條件都為：95℃預熱5m in，30個循環（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s），72℃延伸5m in。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 長雙歧桿菌PCR鑒定計數

1.2.2.1 長雙歧桿菌平板計數 長雙歧桿菌酸奶由滅菌牛奶經嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）和長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）混合發酵而成。發酵好的長雙歧桿菌酸奶，參照國標GB/T 4789-34-2008《食品衛生微生物學檢驗雙歧桿菌檢驗》做法，系列稀釋，選擇合適的稀釋倍數，倒BBL瓊脂平板，厭氧培養計數。選擇平均菌落數在30~300間的平皿和稀釋度計數，平均菌落數乘以稀釋倍數得到樣品菌落總數[10]。

1.2.2.2 長雙歧桿菌PCR鑒定 細菌陽性標記PCR引物是16S rRNA的通用引物[11-12]：上游引物16F（5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’），下游引物16R（5’-C TGC TGC CTC CCG TAG GAG-3’）。PCR產物長度為300bp左右。

對發酵的長雙歧桿菌菌株的16S rRNA和23S rRNA之間的間區基因序列進行測序，具體操作參照文獻[10]。NCBI網上比對分析，設計長雙歧桿菌定性PCR引物，上游引物B-F（5’-CCA TCA TCC GCT TTC G-3’），下游引物B-R（5’-TGG CAG ACA GGA CCG ATG-3’），PCR產物長度為215bp。

PCR擴增反應液組成（總體積30μL）：上游引物（5μmol/L）3μL，下游引物（5μmol/L）3μL，2.5mmol/L dNTP 2.4μL，10×PCR Buffer 3μL，模板DNA 1μL，Taq DNA聚合酶1U，加去離子水至30μL。

所采用的PCR擴增條件都為：95℃預熱5m in，30個循環（95℃，30s；55℃，30s；72℃，30s），72℃延伸5min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

長雙歧桿菌發酵酸奶培養計數后，找出菌落數在30~300之間的平板，挑選一定數量的單菌落，標記編號，用滅菌槍頭吸取菌體；在平板空白處吸取培養基作為陰性對照監測PCR污染。提取菌體DNA，做PCR鑒定。根據PCR鑒定為陽性的長雙歧桿菌所占的比例，以及平板計數的菌落總數計算出目標細菌的數量。

1.2.3 鏡檢驗證 用10μL滅菌槍頭吸取對應編號菌體，懸浮于20μL無菌水，涂片。結晶紫簡單染色，鏡檢觀察。

2 結果與分析

2.1 抽提方法

2.1.1 菌體吸取量對PCR的影響 由于平板上長出的菌落大小、位置不定，吸取菌體量有波動，是否對PCR有影響必須研究。吸取長雙歧桿菌劃線平板單菌落，梯度稀釋后加入裂解液（pH8.0）抽提，用細菌16S rRNA通用引物325F和1367R做PCR，電泳結果見圖1。吸取的菌體量減少到100倍，PCR條帶可以；吸取的菌體量減少到1000倍，仍有PCR條帶。正常吸取的菌體量波動在10倍以內，因此菌體吸取量對PCR鑒定無影響。

2.1.2 提取液pH對PCR的影響 吸取長雙歧桿菌劃線平板上的單菌落菌體，加入不同pH裂解液抽提，用細菌16S rRNA通用引物325F和1367R做PCR，電泳結果見圖2所示。pH8.0的效果較差，pH8.3和pH8.6的效果都較好；pH 8.9的沒有PCR條帶，可能沸水浴時模板DNA降解或者裂解液影響隨后PCR體系的pH。考慮到PCR緩沖液的pH8.3，因此，裂解液的最佳pH 8.3。

圖2 提取液pH對PCR影響Fig.2 The effectof DNA extraction pH for PCR product

2.1.3 抽提方法通用性 抽提方法通用性決定著實驗結果的可靠性。吸取不同益生菌的劃線平板單菌落菌體，加入裂解液（pH 8.3），提取菌體DNA，用細菌16S rRNA通用引物325F和1367R做PCR，電泳結果見圖3。不同細菌的抽提物都有PCR條帶且都較強，說明本研究的菌體DNA抽提方法的通用性好。

圖3 抽提方法通用性Fig.3 Generality of themethod for extracting bacterial genomic DNA

2.2 長雙歧桿菌PCR引物特異性驗證

圖4 長雙歧桿菌PCR引物特異性Fig.4 Specificity of the PCR primers for Bifidobacterium longum

對包括長雙歧桿菌在內8種的不同益生菌，分別吸取單菌落菌體，加入裂解液（pH 8.3），提取菌體DNA，用長雙歧桿菌定性引物和細菌陽性標記引物做PCR，電泳結果見圖4。所有細菌的陽性標記PCR都有條帶；但長雙歧桿菌定性PCR只特異性擴增長雙歧桿菌（圖4中編號為4、5），而其它細菌，特別與它相近的雙歧桿菌（如動物雙歧桿菌等）都沒有擴增條帶。本實驗說明長雙歧桿菌定性PCR的特異性強，可以作為益生菌混合培養的計數。

2.3 長雙歧桿菌PCR計數結果

2.3.1 長雙歧桿菌PCR計數 長雙歧桿菌酸奶經過平板培養計數，得到長雙歧桿菌可疑菌落數總數為6.5×108cfu/g。隨機選擇20個分散的菌落，編號標記，用滅菌槍頭吸取菌體，在平板空白處吸取培養基作為陰性對照監測PCR污染。提取菌體DNA，做PCR鑒定。PCR產物電泳條帶分為以下三種情況：

a.只有細菌陽性標志擴增條帶（300bp左右）而無長雙歧桿菌擴增條帶（215bp），則所檢測的菌落不是長雙歧桿菌，而是其他細菌。

b.細菌陽性標志和長雙歧桿菌2條擴增條帶都沒有，則所檢測的菌落基因沒有裂解好或沒有吸到菌體。

c.有細菌陽性標志和長雙歧桿菌2條擴增帶，則所檢測的菌落為長雙歧桿菌。

所選取的20個菌落都有細菌陽性標志PCR條帶，其中14個為長雙歧桿菌，比率為7∶10；乘上BBL瓊脂平板計數結果（6.5×108cfu/g），得到所檢測的酸奶中長雙歧桿菌的菌落數為4.6×108cfu/g。陰性對照的2對PCR引物都沒有條帶，說明培養基中含有的核酸物質不能擴增，對PCR鑒定計數沒有影響。

圖5 長雙歧桿菌平板計數PCR擴增結果Fig.5 PCR bands of the colonies by Bifidobacterium longum plate count

2.3.2 鏡檢驗證 對2.3.1所述平板上對應編號的20菌落，全部涂片鏡檢。結果通過長雙歧桿菌PCR鑒定為陽性菌落的菌體形態都如圖7相似，為雙歧桿菌的典型特征（長而彎曲的桿狀[13]）；所有陰性菌落顯微圖片都如圖6相似，為球菌；鏡檢中未發現其它桿菌。鏡檢結果進一步驗證PCR計數方法的特異性和準確性，沒有交叉污染。

3 結論

本研究將PCR技術與傳統平板計數技術有機地結合起來，初步建立了混合發酵酸奶中長雙歧桿活菌計數方法。操作簡單，特異性強，抗干擾強，試劑無毒、無害，能夠計數樣品中活活菌，適合混合細菌樣品中的特定益生菌活菌計數研究。通過設計菌株特異性PCR引物可以區分同種不同菌株的細菌，為益生菌的研究和應用打下基礎；同時也為其它計數方法提供參考標準。傳統的細菌學檢驗與鑒定需要進行培養和一系列生化反應檢測，方法復雜費時，需要至少2~3d時間；而PCR鑒定計數過程可以在1d之內完成，因此本研究計數方法快速、準確。

研究出的抽提方法操作簡便、高效、靈敏、通用，同時可以克服培養基中污染基因物質干擾。抽提方法的靈敏性決定著PCR計數方法的靈敏性，正常吸取菌體量稀釋100倍仍有PCR擴增條帶，充分保證PCR計數方法的可靠性和靈敏性。只要待檢測的目標細菌含量可以用常規平板計數方法的，都可以用PCR進行菌落鑒定計數。

總之，本研究為食品中益生菌菌數快速準確的檢測；為開發和生產高質量的發酵乳產品提供研究基礎。

圖6 非長雙歧桿菌菌落顯微圖Fig.6 Micrograph of the non-Bifidobacterium longum colony

圖7 長雙歧桿菌菌落顯微圖片Fig.7 Micrograph of the Bifidobacterium longum colony

[1]葉倩.PCR技術綜述[J].科技創新導報，2009（5）：5.

[2]Houpikian P，RaoultD.16S/23SrRNA intergenic spacer regions forphylogenetic analysis，identification，and subtypingofbartonella species[J].JClin Microbiol，2001（8）：2768-2778.

[3]李琳，李槿年，余為一.細菌分類鑒定方法的研究概況[J].安徽農業科學，2004（3）：550.

[4]王庭柱，高學軍，叢玉婷，等.發酵乳球菌菌株的PCR鑒定[J].食品科學，2007（3）：206-207.

[5]楊文敏，何敏.PCR擴增16s～23s rRNA區間序列在細菌檢測與鑒定領域的應用[J].廣西預防醫學，2000（6）：369-372.

[6]余道軍，童文娟，陳岳明，等.臨床標本細菌基因組DNA提取方法探討[J].中國微生態學雜志，2007（6）：519-520.

[7]沈青春，覃青松，王琴，等.PCR方法測定豬肺炎支原體培養物菌數[J].中國預防獸醫學報，2006（1）：55-57.

[8]鄭維，權春善，樸永哲，等.一種快速提取細菌總DNA的方法研究[J].中國生物工程雜志，2006（4）：75-80.

[9]Palacios L，Vela A I，Molin K，et al.Characterization of some bacterial strains isolated from animal clinical materials and identified as Corynebacterium xerosis by molecular biological techniques[J].JClin Microbiol，2010（9）：3138-3145.

[10]張麗宏，王克新，房玉國.食品中菌落總數測定方法探討[J].中國乳品工業，2005（4）：56-57.

[11]劉文強，賈玉萍，趙宏坤.16S rRNA在細菌分類鑒定研究中的應用[J].動物醫學進展，2006（11）：15-17.

[12]焦振泉，劉秀梅.16s rRNA序列同源性分析與細菌系統分類鑒定[J].國外醫學.衛生學分冊，1998（1）：12-15.

[13]周家春，馮屏.雙岐桿菌屬的生理特征和鑒別[J].廣州食品工業科技，2003（S1）：59-62.

Study on a new method for counting Bifidobacterium longum in yogurt by PCR

ZHANG Hong-fa1，2，REN Jing1，LIU Jing1，YOU Chun-ping1，GU Jin-lin1
（1.State Key Laboratory of Dairy Biotechnology，Technology Center Bright Dairy&Food Co.，Ltd.，Shanghai200436，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi214122，China）

This study tried to initially estab lish a method for counting Bifidobac terium longum in yogurt by using polymerase chain reaction（PCR）technique and traditionalp late countmethod technique.Based on the conserved sequence of 16S rDNA sequences of bacteria，a pair of universal p rimer were designed as a positive mark. And a pair of special p rimers were also designed and synthesized accord ing to 16S～23S rRNA gene of the Bifidobacterium longum.The random ly selected colonies of the m ixed fermented yogurt culturing on BBL agar p late were abstracted and identified by PCR.PCR technology combines w ith the trad itional p late countmethod technology，estab lished the method for counting the living Bifidobacterium longum in the m ixed fermented yogurt.Operation of extraction method must be sim p le，efficient，responsive and accurate，and it determ ined the efficient of PCR counting method.This study focused on the factors that influencing the bacterial DNA extraction，as well as the versatility of the bacterial DNA extraction，but also the specificity of the PCR p rimers for Bifidobac terium longum.A method for counting Bifidobacterium longum in yogurtwas initially estab lished by using polymerase chain reac tion（PCR）technique and trad itionalp late countmethod technique.

PCR；counting；Bifidobacterium longum

TS252.54

A

1002-0306（2012）14-0188-04

2011－10－28

張紅發（1977-），男，本科，中級職稱，主要從事乳品微生物方面的研究。

乳業生物技術國家重點實驗室籌建項目（10dz2221100）；上海乳業生物工程技術研究中心項目（09DZ2251400）。