麝香草酚抑菌活性及其影響因素研究

王 娣，謝海偉，曹珂珂，柯春林，錢時權，石亞中，任茂生

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030）

麝香草酚抑菌活性及其影響因素研究

王 娣，謝海偉，曹珂珂，柯春林，錢時權，石亞中，任茂生

（蚌埠學院生物與食品工程系，安徽蚌埠 233030）

采用濾紙片法和擴散法，研究不同濃度的麝香草酚對食品中常見10種污染菌的體外抑菌作用，并對其抑菌影響因素進行了研究。實驗結果表明，麝香草酚對細菌、酵母和霉菌均有一定抑制作用。經測定，麝香草酚對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱乳酸鏈球菌、異常漢遜氏酵母、釀酒酵母、黑曲霉、黃曲霉的最低抑菌濃度分別為10、20、20、40、40、40、80、40、80、160μg/mL。抑菌影響因素研究表明，吐溫-80和有機氮（BSA）能明顯消弱麝香草酚的抑菌能力；低pH則會明顯增強麝香草酚的抑菌作用。

麝香草酚，抑菌活性，最低抑菌濃度，影響因素

麝香草酚（Thymol），別名百里酚、5-甲基-2-異丙基酚，是一種單萜酚，主要存在于唇形科百里香屬植物中，是百里香屬植物揮發油的主要成分[1-2]。百里香屬植物是一種多用途植物，在我國主要分布于甘肅、內蒙古、陜西、山西等地區[3]，可作為天然調味品、藥用植物、蜜源植物等開發利用。目前使用的麝香草酚多從百里香屬植物揮發油中提取[4-6]，具有宜人香氣。鐘少樞等[7]采用麝香草酚等七種單離食用香料對食品腐敗菌的抑菌活性進行了研究，結果表明麝香草酚對細菌、霉菌和酵母均具有一定的抑制能力。閉興明等人[8]測定了麝香草酚對臨床分離紅色毛癬BMU01672株、釀酒酵母標準株和24株臨床分離耐氟康唑（FLC）白色念珠菌的最小抑菌濃度，發現麝香草酚有較好的抗真菌活性。麝香草酚具有抑菌作用機理可能是[9]：與細胞膜蛋白質相互作用，引起跨膜質子的倒流，影響了由質子驅動供能的細胞活性；或者與微生物生長所必需物質結合，導致微生物死亡等。本文嘗試采用濾紙片法及擴散法研究麝香草酚對食品中10種常見污染菌的抑制活性，并對其影響因素進行初探，為其作為天然食物防腐劑的開發應用提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料與設備

麝香草酚 無色片狀結晶，有特殊香味，分子式C10H14O，麝香草酚＞98%，分析純，天津博迪化工股份有限公司；金黃色葡萄球菌（StapHylococcus aureus）GIM 1.55、枯草芽孢桿菌（Bacillus Subtilis）GIM 1.131、大腸桿菌（Escherichia coli）GIM 1.154、變形桿菌（Proteus vulgaris）GIM 1.192、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）GIM 1.189、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococus thermopHilus）GIM 1.83、酵母異常漢遜氏酵母（Hansenula anomala）GIM 2.18、釀酒酵母（Saccharmuces cerevisiae）GIM 2.34、霉菌黑曲霉（Aspergillusniger）GIM 3.24、黃曲霉（Aspergillus flavus）GIM 3.18 廣州微生物研究所；牛肉膏蛋白胨培養基（BPA） 培養金黃色葡萄球菌（StapHylococcusaureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus vulgaris），用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基，每100m L中加入95%的酒精5m L（BPAE）；乳酸細菌培養基（MRS瓊脂培養基） 培養保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱乳酸鏈球菌（Streptococus thermopHilus）；馬鈴薯汁葡萄糖瓊脂培養基（PDA） 培養異常漢遜氏酵母（Hansenula anomala）、釀酒酵母（Sacchromuces cerevislac）、黑曲霉（Aspergillus niger）、黃曲霉（Aspergillus flavus）。

LRH-150-II智能生化培養箱、SW-CJ-2F超凈工作臺 上海一恒科學儀器有限公司；LDZX-40BI高壓滅菌鍋 北京京儀東方科技有限公司；LX41多功能顯微鏡 上海富眾生物科學有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸浮液的制備 將供試菌種劃線接入試管斜面培養基上，細菌于37℃恒溫培養箱中培養24h，酵母于28℃培養48h，霉菌于28℃培養5d，4℃冰箱中冷藏備用。用接種環分別挑取少許培養成熟的細菌、酵母菌和霉菌孢子于裝有玻璃珠和10m L無菌生理鹽水的三角瓶中，振蕩，采用活菌計數法測定菌數[10]，制成菌體或孢子濃度為106~107CFU/m L均勻的菌懸浮液或孢子懸液。

1.2.2 不同濃度麝香草酚的制備 由于麝香草酚不溶于水，可加入少許吐溫-80增溶[11]，再加適量無菌水超聲乳化、定容，配制成500、800、1000μg/m L系列濃度的麝香草酚（吐溫-80含量不超過0.5%）。以0.5%的吐溫-80作為對照。

1.2.3 濾紙片法[12]取滅菌后的濾紙圓片（d=6mm）于麝香草酚中浸泡10min，瀝去多余液體，置于已用0.1m L菌懸液涂布均勻的培養皿中，每個菌種做3次平行。細菌恒溫培養24h，酵母培養48h，霉菌培養5d，測量抑菌圈直徑。

1.2.4 擴散法（打孔法）[13]用無菌打孔器（孔徑6mm）在用0.1m L菌懸液涂布均勻的培養皿中十字對稱打4個孔，用無菌微量移液器分別加入100μL不同濃度的麝香草酚，每種菌做3個平行，測量抑菌圈直徑。

1.2.5 最低抑菌濃度（MIC）的測定[13]用無菌打孔器（孔徑6mm）在用0.1m L菌懸液涂布均勻的培養皿中打4個孔，其中一個加0.5%的吐溫-80作為對照，其它分別加入2.5～320μg/m L系列濃度的麝香草酚100μL，每種菌做3個平行，得到最低抑菌濃度（M IC）。

1.2.6 麝香草酚抑菌作用的影響因素研究

1.2.6.1 乳化劑（吐溫-80）對麝香草酚抑菌作用的影響 麝香草酚加吐溫-80增溶，稀釋，使制備的培養基中麝香草酚含量達到200μg/m L，吐溫-80（含量為0.25～8μL/m L）系列濃度。選取對麝香草酚敏感的3種供試菌：StapHylococcus aureus、Bacillus subtilis、Escherichia coli，制備菌懸浮液，取0.1m L菌懸液在上述培養基中涂布均勻，培養成熟，計算各皿菌落數，計算lgCFU/m L。

1.2.6.2 有機氮（BSA）對麝香草酚抑菌作用的影響麝香草酚加吐溫-80增溶，稀釋，使制備的化學合成培養基中麝香草酚含量為200μg/m L。將8mg/m L牛血清白蛋白（BSA）添加到化學合成培養基中，取0.1m L菌懸液在上述培養基中涂布均勻，培養成熟，計算lgCFU/m L。

1.2.6.3 pH對麝香草酚抑菌作用的影響 麝香草酚加吐溫-80增溶，稀釋，使制備的培養基中麝香草酚含量為200μg/m L，吐溫-80含量為4μL/m L，將培養基的pH分別調至5.0、5.5、6.0、6.5。取0.1m L菌懸液在上述培養基中涂布均勻，培養成熟，計算lgCFU/m L。

2 結果與分析

2.1 濾紙片法及擴散法抑菌測試結果

表1 濾紙片法測得不同濃度麝香草酚的抑菌直徑（mm）Table 1 The antimicrobial diameter of different concentration thymol by filter paper disks tests（mm）

表2 擴散法測得不同濃度麝香草酚的抑菌直徑（mm）Table 2 The antimicrobial diameter of different concentration thymol by diffused tests（mm）

抑菌活性研究表明見表1、表2，麝香草酚對細菌、酵母和霉菌均有較強的抑制作用，是一種廣譜性抑菌劑。當麝香草酚含量為1000μg/m L時，濾紙片法測定的抑菌直徑大小次序為：Escherichia coli＞StapHylococcus aureus＞Bacillus subtilis＞Saccharmuces cerevisiae＞Proteus vulgaris＞Lactobacillus bulgaricus＞Streptococus thermopHilus＞Hansenula anomala＞Aspergillus niger＞Aspergillus flavus。擴散法測定的抑菌直徑大小次序為：StapHylococcus aureus＞Escherichia coli＞Bacillus subtilis＞Lactobacillus bulgaricus＞Proteus vulgaris＞Saccharmucescerevisiae＞Hansenulaanomala＞StreptococusthermopHilus＞Aspergillusniger＞Aspergillus flavus。抑菌結果之所以有差別，可能是每次加入的菌懸液濃度有誤差，或者實驗操作有誤差所致。

2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測定

麝香草酚對10種供試菌的最低抑菌濃度：StapHylococcus aureus10μg/m L；Bacillus subtilis“－”表示抑菌實驗陰性。

20μg/m L；Escherichia coli20μg/m L；Proteus vulgaris40μg/m L；Lactobacillusbulgaricus40μg/m L；Streptococus thermopHilus40μg/m L；Hansenula anomala80μg/m L；Saccharmuces cerevisiae40μg/m L；Aspergillus niger80μg/m L；Aspergillus flavus160μg/m L。細菌的最低抑菌濃度為10～40μg/m L，酵母的最低抑菌濃度為40～80μg/m L，霉菌的最低抑菌濃度為80～160μg/m L。由表3可以看出，麝香草酚對細菌抑制作用＞酵母菌＞霉菌。對霉菌抑制作用相對較弱可能是由于霉菌大多是通過孢子繁殖，而麝香草酚是通過培養基擴散與細胞接觸，因而對孢子抑制作用稍差。

表3 麝香草酚對供試菌的最低抑菌濃度Table 3 MIC of thymol to differentbacteria

2.3 影響麝香草酚抑菌作用因素研究

2.3.1 乳化劑（吐溫-80）對麝香草酚抑菌作用的影響 由表4可知，乳化劑吐溫-80對麝香草酚的抑菌作用會產生一定影響。培養基中麝香草酚的濃度為200μg/m L，完全可以抑制供試菌的生長。培養基中吐溫-80濃度較低時（＜1.0μL/m L），檢測不到細菌菌落。當吐溫濃度由1.0μL/m L增加到8.0μL/m L時，StapHylococcus aureus菌數則由8.3（lgCFU/m L）增加到11.3（lgCFU/m L），這說明隨著吐溫-80濃度的增加，麝香草酚的抑菌作用在消弱，細菌的菌落數不斷上升。分析原因可能是麝香草酚與供試菌的細胞膜蛋白質通過氫鍵或疏水作用相結合，使蛋白質變性或失活，造成細菌細胞生理功能紊亂死亡，這種現象會被吐溫-80乳化劑消弱，因為乳化劑也能與酚類物質結合，所以降低了和供試菌蛋白質結合的麝香草酚相對濃度。此外，吐溫-80還有增溶作用，會增加麝香草酚在水中的溶解度，減少其在細胞膜上的濃度，使麝香草酚和供試菌蛋白質結合的數量和程度大為下降，降低了麝香草酚的抑菌能力。

表4 吐溫-80濃度對麝香草酚抑菌作用的影響Table 4 Effectof Tween 80 concentration on antimicrobial activity of thymol

表5 BSA對麝香草酚抑菌作用的影響Table 5 Effect of BSA on antimicrobial activity of thymol

2.3.2 有機氮（BSA）對麝香草酚抑菌作用的影響 由表5可知，有機氮（BSA）對麝香草酚的抑菌能力有明顯的減弱作用。在不加牛血清白蛋白（BSA）只加麝香草酚的化學合成培養基上，麝香草酚表現出較強的抑菌作用，細菌基本上不能生長。同時添加了麝香草酚和牛血清白蛋白（BSA）的培養基上，BSA可基本抵消麝香草酚的抑菌作用。可能是BSA與麝香草酚結合，使麝香草酚和細胞膜蛋白質結合的機會和能力大大下降，降低了麝香草酚的抑菌作用。

2.3.3 pH對麝香草酚抑菌作用的影響 由表6可知，隨著pH的降低，麝香草酚的抑菌能力逐漸增強。pH為6.5時，有大量細菌生長；pH降低為5時，細菌基本上不能生長。可能是低pH降低了細菌活性，改變了細菌生長的外環境，使細菌不易生存，或者使麝香草酚的疏水性增加，使其更利于和細菌細胞膜上的蛋白質結合，使蛋白質變性或活性降低，造成細胞死亡。

表6 pH對麝香草酚抑菌作用的影響Table 6 Effectof pH on antimicrobial activity of thymol

3 結論

麝香草酚對食品中常見的細菌、酵母菌和霉菌有一定抑菌作用。抑菌影響因素研究表明，隨著吐溫-80濃度的增加，麝香草酚的抑菌能力會明顯消弱；培養基中添加有機氮（BSA）會明顯消弱麝香草酚的抑菌能力；低pH則會明顯增強麝香草酚的抑菌能力。從植物中尋找毒副作用小、安全性高的天然植物防腐劑，一直是科學工作者研究的熱點[14]。麝香草酚是從可食用植物中提取出來的，安全性高，資源豐富，希望作為一種良好的天然食品防腐劑開發使用。

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Study on antim icrobialactivity of thymoland its influencing factors

WANG Di，XIE Hai-wei，CAO Ke-ke，KE Chun-lin，QIAN Shi-quan，SHIYa-zhong，REN Mao-sheng
（Departmentof Biology and Food-Engineering，Bengbu College，Bengbu 233030，China）

The antim icrobial activity of thymol to 10 im portant foodborne pathogens bacteria and influencing factors were studied by means of filter paper disks and d iffused tests.The results showed that foodborne pathogens bacteria were obviously inhibited.The test ob tained the m inimum inhibition concentrations of thymol to foodborne pathogens bac teria，inc lud ing StapHylococcus aureus，Bacillus sub tilis，Escherichia coli，Proteus vulgaris，Lactobacillus bulgaricus，Strep tococus thermopHilus，Hansenula anomala，Saccharmuces cerevisiae，Aspergillus niger，Aspergillus flavus，were as follows：10，20，20，40，40，40，80，40，80 and 160μg/m L.The factors affecting antibac terial action experiment results showed that Tween-80 and BSA remarkab ly decreased the antibac terialaction and low pH condition strong ly increased antibacterialaction.

thymol；antim icrobialactivity；m inimum inhibition concentrations（MIC）；influencing factor

TS201.2

A

1002-0306（2012）14-0096-04

2011－12－05

王娣（1976-），女，碩士，副教授，主要從事食品生物技術的教學和研究工作。

安徽省高校優秀青年人才基金項目（2010SQRL116）。