UPLC-MS/MS檢測柑桔不同組織中的檸檬苦素

江 海，李新生，*，吳三橋，劉 新，韓 豪，高 玥，彭 浩

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中 723000）

UPLC-MS/MS檢測柑桔不同組織中的檸檬苦素

江 海1，2，李新生1，2，*，吳三橋1，劉 新1，韓 豪1，高 玥1，彭 浩1，2

（1.陜西理工學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中 723000；2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中 723000）

目的：檢測柑桔果皮、果肉、桔絡(luò)以及桔籽中檸檬苦素的含量，分析柑桔加工中苦味物質(zhì)的來源。方法：用UPLC－MS/MS法檢測，色譜柱：waters ACQUITY BEH C18（50mm×2.5mm，1.9μm）；流動相：A為乙腈，B為純水，采用梯度洗脫：A：10%（0min）－50%（3min）－10%（4min）－10%（5min）；流速：0.3mL/min；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5μL；檢測時(shí)間：5min；正離子模式（ESI+）質(zhì)譜檢測器：檸檬苦素母離子m/z=471.1，子離子m/z=425.3，m/z=161.1。結(jié)果：在檢測色譜－質(zhì)譜條件下檸檬苦素檢測效果良好，柑桔中檸檬苦素含量依次為：桔籽＞桔絡(luò)＞桔皮＞桔肉。結(jié)論：柑桔加工中盡量選用無籽品種，采用手工剝皮，同時(shí)剔除桔絡(luò)能有效地避免產(chǎn)品的苦味。

UPLC－MS/MS，測定分析，柑桔，組織，檸檬苦素

柑桔是世界第一大水果，在全球140個(gè)國家和地區(qū)均有種植，全球柑桔常年總產(chǎn)量為6000～10000萬t，其中柑桔產(chǎn)量居世界前3位的分別為巴西、美國和中國[1－3]。2007年我國柑桔種植面積達(dá)191×104hm2，約占世界柑桔種植總面積的25%，產(chǎn)量達(dá)2059×104t，占世界總產(chǎn)量的17%，我國柑桔種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[4]。柑桔是果汁生產(chǎn)的主要原料，柑桔汁產(chǎn)量約占世界果汁總量的67%[5]，但我國缺乏柑桔加工優(yōu)勢企業(yè)，柑桔多為鮮食，柑桔加工率不足10%，常有柑桔豐產(chǎn)滯銷現(xiàn)象。柑桔滯銷已成困擾柑桔業(yè)發(fā)展的難題。解決我國柑桔滯銷問題，最可行的辦法就是發(fā)展柑桔深加工。但是，柑桔加工（特別是果汁生產(chǎn)）過程中所出現(xiàn)的苦味問題成為制約我國柑桔加工業(yè)發(fā)展的瓶頸。柑桔苦味主要來自檸檬苦素類（Limonins）和柚皮苷類物質(zhì)（Naringin）。檸檬苦素類似物廣泛存在于柑桔屬植物中，其中含量的高低直接影響柑桔的品質(zhì)。柑桔通常鮮食無苦味，但經(jīng)榨汁、殺菌等加工處理后就表現(xiàn)出苦味，這種現(xiàn)象稱之為“延遲苦味”。據(jù)報(bào)道，柑桔汁出現(xiàn)“延遲苦味”的原因主要是在酸性條件和檸檬苦素D環(huán)內(nèi)酯水解酶的催化下，果實(shí)中所存在的非苦味的檸檬苦素A-環(huán)內(nèi)酯轉(zhuǎn)變成了具有強(qiáng)烈苦味的檸檬苦素[6-10]。檸檬苦素含量的高低直接影響柑桔及其產(chǎn)品的品質(zhì)，測定檸檬苦素的含量可用于控制柑桔及其相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。已報(bào)道的檸檬苦素檢測方法很多，主要有Davis法、分光光度法、薄層色譜法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）等[11-14]，但因檸檬苦素類似物配糖體極性強(qiáng)，在提取液中常與許多雜質(zhì)共存，因而對其檢測及純化都很困難，多數(shù)檢測方法效果不佳。這里采用UPLC-MS/MS檢測了柑桔果皮、果肉、桔絡(luò)以及桔籽不同組織中檸檬苦素的含量，分析柑桔加工中苦味物質(zhì)的來源，旨在為柑桔的深加工提供一些參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

柑桔樣品 2010年11月采于陜西省城固縣郭家山泛亞柑桔種植基地；桔皮樣品 手工剝皮，經(jīng)烘箱60℃烘干、粉粹，過60目分樣篩，備用；桔籽樣品 從桔子中剔除桔籽，烘箱60℃烘干、粉粹，過60目分樣篩，備用；桔絡(luò)樣品 桔瓤外白色的網(wǎng)狀筋絡(luò)通常被稱之桔絡(luò)，手工撕下桔絡(luò)，烘箱60℃烘干、粉粹，過60目分樣篩，備用；桔肉樣品 將去皮，去籽，剔除桔絡(luò)的柑桔60℃烘干，粉碎，備用；檸檬苦素 純度99.8%，天津一方科技有限公司；乙腈 色譜純，Burdick and Jackson公司；甲醇、石油醚、丙酮 分析純，天津市登峰化學(xué)試劑廠；超純水 娃哈哈廣元純水公司。

ACQUITY UPLC型超高效液相色譜、ACQUITY TQD型三重四級桿質(zhì)譜儀配MassLynxTMMS軟件 美國Waters公司；水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；SHIMADZU AUW 220D型十萬分之一電子天平、SHIMADZU AUY220型萬分之一電子天平 日本島津公司；SK 1200H型超聲波清洗機(jī) 無錫市興邦基業(yè)電子有限公司；BM 252C型榨汁機(jī) 美的公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 Waters ACQUITY BEH C18（50mm× 2.5mm，1.9μm），柱溫40℃，流速0.3m L/m in，進(jìn)樣5μL。流動相為：水：乙腈梯度洗脫，乙腈梯度為10%（0m in）-50%（3m in）-10%（4m in）-10%（5m in）。

1.2.2 質(zhì)譜條件 毛細(xì)管電壓3.2kV，錐孔電壓40kV，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度400℃，錐孔氣流量50L/h，脫溶劑氣流量800L/h。離子化模式為大氣壓電噴霧離子源正離子模式（ESI+），碰撞池電壓（collision V）30V，碰撞氬氣流速0.14m L/m in。采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM），檸檬苦素母離子m/z=471.1，子離子m/z=425.3、m/z=161.1。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品2.85mg，用10m L乙腈溶解，超純水定容至25.0m L。制得檸檬苦素114mg/L的標(biāo)準(zhǔn)對照母液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 取檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0m L，用50%的乙腈水溶液定容于10m L容量瓶。得到檸檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。在儀器設(shè)定的色譜-質(zhì)譜條件下，通過0.22μm濾膜過濾，進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)梯度樣品各5μL，以檸檬苦素母離子m/z=471.1進(jìn)行選擇，m/z=425.3為定性離子，m/z=161.1為定量離子。

1.2.5 定量限實(shí)驗(yàn) 將檸檬苦素0.57μg/m L的標(biāo)準(zhǔn)溶液逐級稀釋，在液相質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析，以S/N=10，確定檸檬苦素的定量限。

1.2.6 樣品溶液制備 稱取干燥的桔皮、桔籽、桔絡(luò)、桔肉各3.0g于250m L的圓底燒瓶中，量取50.0m L石油醚（30~60℃）于40℃超聲脫脂30min，抽濾，棄去濾液；向?yàn)V渣中加入50.0m L丙酮，40°C超聲提取30m in，過濾；濾液揮干，用50%乙腈-水（V∶V）溶液定容至50.0m L。過0.22μm有機(jī)微孔濾膜后在設(shè)定的液相-質(zhì)譜條件下檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性范圍

標(biāo)樣色譜圖見圖1。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)擬合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，檸檬苦素線性回歸方程為：Y=62.7883X+11.245，r=0.99954。該檢測條件下，檸檬苦素在2.85～114ng之間線性關(guān)系良好。

圖1 檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)品色譜-質(zhì)譜圖Fig.1 The limonin’s chromatogram of standard

2.2 定量限確定

經(jīng)實(shí)驗(yàn)，在液相-質(zhì)譜分析條件下進(jìn)樣分析得到S/N=10，計(jì)算得檸檬苦素的定量檢測限為2.8ng/m L。

2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取桔籽樣品，按1.2.6方法制備樣品，在色譜-質(zhì)譜條件下平行測定5次，每次進(jìn)樣5μL，測定檸檬苦素的峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。其中檸檬苦素的峰面積分別為850.2、845.6、878.3、866.7、835.5，RSD=2.00%（n=5），結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

取桔籽樣品，按1.2.6方法制備，在色譜-質(zhì)譜條件下，分別在0.5、1、6、12、24h進(jìn)樣5μL檢測檸檬苦素的峰面積，分別為866.4、895.3、875.8、832.9、885.3，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，求得RSD為2.75%（n=5）。結(jié)果表明在該方法條件下，檸檬苦素穩(wěn)定。

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

精密量取已測定檸檬苦素為218.49mg/kg的桔肉3.0g，加入5.70mg檸檬苦素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，按1.2.6方法制備樣品條件平行制備3份，在色譜-質(zhì)譜條件下測定，計(jì)算檸檬苦素的回收率，結(jié)果如表1所示。

表1 回收率測定結(jié)果Table 1 Themeasurement results of recovery

從表1可知，檸檬苦素的平均回收率為99.53%，RSD=2.91%（n=3）。同樣的方法計(jì)算桔籽的平均回收率為99.32%，RSD=2.15%（n=3）；桔絡(luò)的平均回收率為101.54，RSD=2.54%（n=3）；桔皮的平均回收率為100.85%；RSD=3.14%（n=3）。結(jié)果表明方法準(zhǔn)確可靠。

2.6 柑桔中不同組織檸檬苦素質(zhì)量濃度的測定結(jié)果

依樣品制備方法和測定條件，對桔籽、桔絡(luò)、桔肉、桔皮樣品中的檸檬苦素質(zhì)量濃度測定，色譜-質(zhì)譜圖見圖2，結(jié)果見表2。

圖2 桔籽中檸檬苦素色譜-質(zhì)譜圖Fig.2 The limonin’s chromatogram of citrus seeds

表2 樣品測定結(jié)果（n=3）Table 2 Themeasurement results of samples

柑桔中各個(gè)部分均含有檸檬苦素，其中桔籽、桔絡(luò)中檸檬苦素含量較高，桔肉中含量最低。柑桔的含水率在95%左右，將桔肉中檸檬苦素含量換算為柑桔汁中的檸檬苦素含量大概為10mg/kg左右，與直接利用桔子汁進(jìn)行檢測結(jié)果基本相吻合。

3 結(jié)論與討論

在實(shí)驗(yàn)分析過程中，就實(shí)驗(yàn)樣品的處理進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)。檸檬苦素在桔肉中含量較低，為了與桔籽、桔絡(luò)、桔皮檢測干燥樣品相比較，我們采用將桔肉烘干的辦法。但桔肉檢測的最終結(jié)果通過含水率換算后，比直接采用桔汁檢測大15%左右，這可能與桔子汁的后苦效應(yīng)有關(guān)，同時(shí)也與桔肉樣品處理步驟增多，增加結(jié)果檢測誤差有關(guān)。如要測定桔汁的檸檬苦素含量，最好直接采用桔汁提取后檢測。在色譜條件的選擇上曾使用HPLC結(jié)合VWD（紫外-可見吸收）檢測，因檢測波長在203nm，分析基線噪音很大，結(jié)果不理想，同時(shí)HPLC分析時(shí)間較長。采用UPLC后，分離效率明顯提高；采用DAD（二極管陣列）檢測，檢測效果較VWD好，但檢出限較高，重復(fù)性較差，對低含量檸檬苦素?zé)o法檢測。采用UPLC-MS/MS分析，分離效果好，檢出限低，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，為實(shí)驗(yàn)所選擇。柑桔中的檸檬苦素主要存在于桔籽和桔絡(luò)中，柑桔皮除含有檸檬苦素，還含有柚皮苷類致苦物質(zhì)，在桔汁加工中清除桔皮，桔籽和桔絡(luò)能有效避免苦味物質(zhì)的產(chǎn)生。但在實(shí)際工業(yè)加工中，桔子去皮可通過工藝改進(jìn)實(shí)現(xiàn)，去籽和去桔絡(luò)則難度太大，暫無有效方法。鑒于此，建議桔汁加工原料盡量選用無籽和桔絡(luò)較少的柑桔品種。為利于柑桔加工，柑桔種植基地可進(jìn)行無籽、少桔絡(luò)柑桔品種的育種和推廣。

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Detection of limonin in citrus with different tissue by UPLC-MS/MS

JIANG Hai1，2，LIXin-sheng1，2，*，WU San-qiao1，LIU Xin1，HAN Hao1，GAO Yue1，PENG Hao1，2
（1.School of Biological Science&Engineering，ShaanxiUniversity of Technology，Hanzhong 723000，China；2.Shaanxi Key Laboratory of Resource Biology，Hanzhong 723000，China）

Ob jec tive：Determ ined the contents of Limonin in citrus peel，citrus flesh，d ried tangerine fibre and citrus seed.Analysis of the source of citrus bitterness substances in p rocessing.Methods：The column was waters ACQUITY BEH C18（50mm×2.5mm，1.9μm）by UPLC-MS/MS，mobile phase：using g rad ient elution，A was acetonitrile and B was water，A：10%（0m in）-50%（3m in）-10%（4m in）-10%（5m in），the velocity of flow was 0.3m L/m in，column temperature was 40℃，injection quantity was 5μL，detection time was 5m in，ESI（+）scan，the limonin’s parents were m/z=471.1，daughter were m/z=425.3 and m/z=161.1.Results：Limonin could be detected in the chromatog raphy-mass spectrum cond itions.The limonin contents discretion order in citrus was citrus seed>d ried tangerine fibre>citrus peel>citrus flesh.Conc lusion：In citrus p rocessing，tried to choose seed less varieties.Using manualskinning，and elim inate d ried tangerine fibre could avoid the bitter.

UPLC-MS/MS；determ ination；c trus；tissue；limonin

TS255.1

A

1002－0306（2012）14－0087－03

2011－12－13 *通訊聯(lián)系人

江海（1977－），男，碩士，實(shí)驗(yàn)師，研究方向：生物資源開發(fā)利用。

陜西省教育廳科研項(xiàng)目（2011GJ21，11JS033）；陜西理工學(xué)院科研資助項(xiàng)目（SLG0814）。