miR-127和miR-136在轉基因克隆綿羊胎盤中的表達分析及其靶基因的鑒定

胡圣偉，倪 偉，陳創夫，賽務加甫，務熱力·哈孜，郭吉星

(1.石河子大學 動物科技學院，新疆 石河子 832000;2.石河子大學 生命科學學院，新疆 石河子 832000)

目前，通過體細胞核移植技術己經成功培 育 出 綿 羊[1]、牛[2]、山 羊[3]、豬[4]、大鼠[5]、騾子[6]和狗[7]等多種哺乳動物，尤其是在利用該技術成功獲得具有一定性狀的轉基因克隆綿羊、牛和豬后，顯示出這一技術誘人的應用前景。但是，體細胞克隆動物在孕期流產率較高，只有少數能發育到妊娠末期或成年，即使存活的克隆動物也存在一些健康和器官發育異常的問題。研究發現很多克隆動物的發育異常都與其胎盤發育缺陷相關[8]。克隆綿羊胎盤發育缺陷導致大量胚胎在妊娠階段發育停滯或流失，胎盤表現出子葉數量減少和血管系統發育缺陷等問題[9]。因此，胎盤發育缺陷是導致克隆動物效率低下的重要原因之一。然而，目前克隆動物胎盤發育異常的分子機制尚不清楚。

MicroRNA(miRNA)是近幾年在真核生物中發現的一類內源性的具有調控功能的非編碼RNA分子，其在轉錄和轉錄后水平上調控基因的表達[10]。miRNA參與細胞的增殖、分化和凋亡等過程，在胚胎和胎盤發育過程中發揮重要的調控作用[11]。miR-127和miR-136是兩個位于印記基因retrotransposon-like(Rtl1)的GC島附近的miRNA，而Rtl1是一個在胎盤發育過程中起到重要調控作用的關鍵基因[12]。Cui等[13]發現，在克隆小鼠囊胚中 miR-127的表達量及其啟動子甲基化水平顯著異常，證實miR-127在體細胞克隆小鼠胚胎中未被正確重編程。推測miR-127的不完全重編程可能導致克隆動物胎盤發育缺陷。然而，miR-127和miR-136是否在克隆動物胎盤中異常表達及其作用機制還未見報道。

在本研究中，運用熒光定量PCR比較了miR-127和miR-136分別在死亡克隆綿羊和普通對照綿羊胎盤中的相對表達量，并運用EGFP熒光報告系統鑒定miR-127和miR-136的靶基因，分析了靶基因在克隆胎盤中的表達情況。結果表明，在克隆綿羊胎盤中miR-127和miR-136基因表達量顯著高于對照綿羊胎盤中的表達量，miR-127和miR-136模擬物可顯著降低Rtl1-EGFP融合基因在細胞中的表達，初步證實Rtl1是miR-127和miR-136的靶基因，并且在克隆綿羊胎盤中的表達量降低了3/5。這些發現為從microRNA角度揭示克隆動物胎盤發育異常的分子機制奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗材料

綿羊卵巢采集于烏魯木齊市屠宰場，4 h內于20～25℃生理鹽水中送回實驗室用于收集綿羊卵母細胞。以40 d的細毛羊胎兒成纖維細胞為核移植的供體細胞。用于對照組的正常受精產生的綿羊胎盤來自石河子大學實驗場。

1.1.2 主要試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP，凝膠回收純化試劑盒、質粒小量制備純化試劑盒和Genomic DNA Kit購自北京 TianGen公司;DNA marker，SYBR Green，PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自takara公司;小RNA分離試劑、熒光定量PCR試劑盒購自Ambion公司。DMEM/F12、胎牛血清購自Gibco公司;miR-127 minics、miR-136 minics和熒光定量PCR引物由Ambion公司合成。

1.2 方法

1.2.1 轉基因克隆綿羊的生產

靶向綿羊肌肉生長抑制素的shRNA表達載體構建、轉染及陽性細胞的篩選[14，15]。卵母細胞的采集與體外成熟培養、體細胞核移植程序[16，17]。2010 年，本研究組共獲得 2只肌肉生長抑制素基因敲的轉基因克隆綿羊。其中1只在出生后即死亡，另一只存活23 d后死亡。選取死亡的2只轉基因綿羊的胎盤作為實驗組(D1和D2)。該組羔羊都表現有不同程度的發育異常。D1存在呼吸問題，胎盤肥大;D2為死胎，胎盤肥大，剖解未見器官異常。另外采集2只普通健康的細毛羊胎盤作為對照組。轉基因綿羊通過PCR和Southern blotting鑒定(另文發表)。

1.2.2 miR-127和miR-136的熒光定量PCR

采用stem-loop qRT-PCR定量分析microRNA的表達量[18]。收集克隆綿羊及對照組綿羊胎盤組織，分別提取總RNA，分別以反轉錄引物(5’-GCG CGT GAG CAG GCT GGA GAA ATT AAC CAC GCG CAG CCAA-3’)和(5’-GCG CGT GAG CAG GCT GGA GAA ATT AAC CAC GCG CTC CATC-3’)逆轉錄合成miR-127和miR-136 cDNA第1鏈，以此反轉錄產物為定量PCR模板。分別以miR-127定量 PCR引物(F:5’-ATCGGATCCGTCTGAG-3’;R:5’ -GAGCAGGCTGGAGAA-3’)及miR-136 定量 PCR引物(F:5’ -CTCCATTTGTTTTGATGATG-3;R:5’-GAGCAGGCTGGAGAA-3’)進行PCR反應，反應條件為:95℃ 1 min變性，95℃ 15 s、60℃ 30 s;40個循環。以sonRNA234為內參進行數據分析。

1.2.3 Rtl1-EGFP表達載體的構建

Sekita報道，miR-127和miR-136的序列與Rtl1基因開放閱讀框內一段序列具有互補性，miR-127和miR-136可能以RNAi方式調控Rtl1基因的表達[12]。本研究利用EGFP基因報告系統進一步驗證。根據GeneBank公布的綿羊Rtl1基因組序列，設計用于擴增包含miR-127靶位點的Rtl1基因片段的引物(F:5’-GCACCTTCCACTCTCCCTACTG-3’;R:5’-GCTTGGCTTTTTCTTGCACC-3’)和包含 miR-136靶位點的Rtl1基因片段的引物(F:5’-ATGATAGAACCCTCTGAAGACTCA-3’;R:5’ -AGATGACAACCCTCGCATGACT-3’)，以胎盤細胞基因組DNA為模板，PCR擴增包含miR-127和miR-136靶位點的Rtl1基因片段。將PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳分離，用凝膠回收試劑盒純化后，克隆至pEGFP-N1載體(Clontech)。經XhoⅠ和SalⅠ雙酶切和測序鑒定后，獲得pRtl127-EGFP和pRtl136-EGFP表達載體。

1.2.4 EGFP熒光敲除實驗

參照Huang等[19]驗證miRNA靶基因的方法，我們利用EGFP熒光敲除實驗驗證miR-127和miR-136的靶基因。綿羊胎兒成纖維細胞的分離培養[14]。在轉染前一天以每孔2×105個細胞接種12孔細胞板，待細胞生長至80%～90%豐度時開始轉染。按照lipofectamine 2000說明書以100 nmol/L工作濃度的 miRNA minics和1.5 μg/孔的 Rtl1-EGFP表達載體，分別按miR-127 minics+pRtl127-EGFP組;miR-136 minics+pRtl136-EGFP組和pRtl136-EGFP組轉染綿羊胎兒成纖維細胞，轉染24 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況。

1.2.5 半定量RT-PCR

按照Trizol RNA提取試劑盒使用說明，提取轉染后的綿羊胎兒成纖維細胞總RNA，并逆轉錄合成cDNA第1鏈。以EGFP基因引物(F:5’ -CGACGTAAACGGCCACAAGT-3’;R:5’ -TCTGCTGGTAGTGGTCGGCG-3’)進行PCR擴增，以綿羊β-actin基因為內參，比較Rtl1-EGFP融合基因在各個處理組細胞中的表達。Rtl1-EGFP融合基因PCR反應條件:95℃預變性5 min;94℃變性30 s，60℃復性30 s，72℃延伸50 s;35個循環，最后72℃延伸10 min。

1.2.6 Rtl1的熒光定量RT-PCR

由于Rtl1蛋白抗體無法獲得，我們采用熒光定量PCR的方法定量分析RTL基因在正常綿羊和克隆綿羊胎盤中的表達量。根據Trizol說明書提取胎盤總RNA，使用反轉錄試劑盒及隨機引物合成cDNA。以此cDNA為模板，用Rtl1引物P1(5’ -GGTCGAACAGTTCTGGAATCA-3’)和 P2(5’ -GGTCGAACAGTTCTGGAATCA-3’)進 行PCR，按照SYBR熒光染料說明書進行熒光定量PCR。PCR反應條件:95℃ 15 s變性，95℃ 15 s、60℃ 15 s;72℃ 15 s 40個循環。以GAPDH為內參，用2-ΔΔCT法計算Rtl1基因相對表達量。

2 結果

2.1 miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中的表達

提取克隆綿羊胎盤(實驗組)及對照組綿羊胎盤組織總RNA，應用熒光定量PCR方法檢測miR-127和miR-136在胎盤組織中的表達情況。結果表明，克隆綿羊胎盤組織中miR-127和miR-136的表達量明顯高于對照組綿羊胎盤組織中的表達量，miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤組織中的表達量分別增加了3.1和2.8倍(圖1)。

圖1 miR-127和miR-136在克隆綿羊和普通綿羊胎盤中的表達分析

2.2 Rtl1為miR-127和miR-136的靶基因

從綿羊胎盤細胞基因組中，通過PCR分別擴增出含miR-136和miR-127靶位點的Rtl1基因序列，長度分別為290 bp和320 bp(圖 2)。將這兩段 Rtl1基因序列克隆至pEGFP-N1載體，經雙酶切及測序鑒定正確，表明成功構建 pRtl136-EGFP和pRtl127-EGFP表達載體。

圖2 miR-127和miR-136的靶位點基因序列的PCR擴增

將miR-127 minics+pRtl127-EGFP、miR-136 minics+ pRtl136-EGFP和pRtl136-EGFP分別轉染綿羊胎兒成纖維細胞。24 h后熒光顯微鏡觀察發現，miR-127 minics+pRtl127-EGFP組和miR-136 minics+pRtl136-EGFP組熒光強度明顯弱于對照組(pRtl136-EGFP)(圖3 A)。半定量RT-PCR檢測發現，miR-127 minics+pRtl127-EGFP組和 miR-136 minics+pRtl136-EGFP組轉染的細胞中Rtl1-EGFP mRNA表達水平顯著減弱(圖3 B)。

圖3 miR-127和miR-136靶基因的鑒定

2.3 Rtl1在克隆綿羊胎盤中的表達分析

提取克隆綿羊胎盤及對照組綿羊胎盤組織總 RNA，應用熒光定量 PCR方法檢測Rtl1在胎盤組織中的表達情況。結果表明與對照組綿羊胎盤組織，克隆綿羊胎盤組織中Rtl1的表達量降低了3/5(圖4)。

圖4 Rtl1在綿羊胎盤中的相對表達量

3 討論

多項研究已經表明，胎盤發育異常可能是造成克隆動物效率低下的主要原因之一，并且很多克隆動物的胎盤都表現出發育缺陷[8，9，20]。最近，李勁松研究組[21]利用四倍體胚胎補償技術直接證明，克隆囊胚滋養外胚層的發育缺陷是克隆胚胎體內發育失敗的主要原因，進一步直接說明胎盤發育缺陷是導致克隆動物效率低下的主要原因。但目前克隆動物胎盤發育異常的分子機制尚不清楚。microRNA是一類重要的細胞生長和分化的調控分子，普通動物胎盤中表達的microRNA對胚胎的著床、胎兒的生長和發育有著重要的調控作用[22，23]。但是目前對克隆綿羊胎盤中microRNA的表達和功能研究尚未見報道。在本研究中，我們分析了miR-127和miR-136在死亡克隆綿羊胎盤組織中的表達情況，驗證了miR-127和miR-136的靶基因及分析了靶基因在胎盤中的表達情況。

本研究應用熒光定量PCR的方法分析了miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中和普通對照綿羊胎盤中的表達量，結果表明miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中表達量顯著高于普通對照綿羊胎盤中的表達量，說明miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中未被正確重編程。Cui等[13]人也報道miR-127和miR-136在克隆小鼠囊胚中未被正確重編程。本研究進一步利用EGFP熒光報告系統證實Rtl1是miR-127和miR-136的靶基因，并且定量分析發現Rtl1基因在克隆胎盤中的表達量明顯降低。表明在綿羊體細胞核移植后，miR-127和miR-136基因未被正確重編程，異常表達的miR-127和miR-136導致靶基因Rtl1基因在克隆胎盤中表達降低。已有研究表明Rtl1基因在胎盤發育過程中的發揮著重要作用，Rtl1基因過表達或缺失可導致胎盤發育異常，進而導致胎兒死亡或者新生小鼠死亡[12]。因此，miR-127和miR-136在克隆綿羊胎盤中的異常表達很可能導致Rtl1基因的低表達，這可能是克隆胎兒發育異常以及死亡的主要原因之一。

鑒于本研究的結果，結合Rtl1在胎盤發育過程中功能研究[12]，我們假設體細胞克隆動物死亡率較高的一個重要原因如下:供體細胞的不完全重編程導致miR-127和miR-136在克隆動物胎盤中的高水平表達，異常表達的miR-127和miR-136導致靶基因Rtl1的低表達，而胎盤中Rtl1的缺失可導致新生克隆動物死亡[12]。但該假設仍需要大量的體內外試驗驗證。

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