VEGF干擾慢病毒載體的構建及其在MHCC97L細胞中的表達

丁治國 何 蓓 陳曉珩 汪唐順 高 翔 李乃卿

1.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；2.北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029

血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是特異性血管內皮細胞有絲分裂素，與受體結合后促進內皮細胞分裂、增殖、遷移，加速形成新生血管。研究表明，VEGF及其受體在肝癌癌組織中較正常肝組織呈過表達，并與肝癌的生長、轉移、復發及治療密切相關[1-3]。因此，VEGF已成為目前腫瘤抗血管治療的熱點。筆者前期研究發現課題組原研藥物參芪扶正注射液可顯著抑制人肝癌細胞MHCC97L的生長、侵襲能力，并能下調VEGF基因表達。為進一步明確VEGF基因“沉默”時藥物作用的變化，本研究構建了能轉錄產生VEGF shRNA的質粒，進而構建并包裝產生高滴度的慢病毒RNAi載體，并實現其在人肝癌細胞MHCC97L中表達，抑制MHCC97L細胞中VEGF基因的表達，為進一步深入研究VEGF基因與參芪扶正注射液藥物效果的關系奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

Platimum HIFI Taq Polymerase高保真擴增酶、Trizol Reagent、5×First-Strand buffer、0.1 mol/L dTT、SYBR Green I、Rnase out、oligo dT/Random primer/特異性引物、10×PCR Buffer、Mg2+（50 mmol/L）、Platinum Taq DNA Polymerase、100 mmol/L

dNTPs（購自美國Invitrogen公司）；T載體、plenti6.3MIR載體、293細胞、DH5α感受態細胞、ddwater（購自上海諾百生物科技有限公司）；T4 Ligase（購自加拿大NEB公司）；DMEM培養基（購自美國HYCLONE公司）；FBS（購自法國biowest公司）；24孔和6孔細胞培養板（購自美國Corning公司）；熒光顯微鏡（購自日本Olympus公司），熒光定量PCR儀（購自美國Bio Rad公司）。

1.2 方法

1.2.1 載體的構建和鑒定 針對人類VEGF基因mRNA序列（NCBI GenBank，基因編號：AF022375），利用 invitrogen 公司BLOCK IT RNAi DESIGNER工具設計干擾序列如下，200-F：TGCTGTGAAGATGTACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA；200-R：TGCTGTGAAGATG TACTCGATCTCATGTTTTGGCCACTGACTGACATGAGATCGTACATCTTCA； Negative-F：TGCTGAAATGTACTGCGCGTGGAGACGTTTTGGCCACTGACTGACGTCTCCACGCAGTACATTT；Negative-R：CCTGAAATGTACTGCGTGGAGACGTCAGTCAGTGGCCAAAACGTCTCCACGCGCAGTACATTTC。將 2對 oligo（包括陰性對照鏈）退火成雙鏈。然后連接線性化的plenti6.3-MIR載體，構建2個miRNA慢病毒載體質粒，并轉化至感受態細胞DH5α。挑選陽性克隆，用載體通用引物進行菌落PCR篩選。篩選得到的陽性克隆進行測序，以驗證重組克隆中插入片段序列是否與設計的oligo序列一致。

1.2.2 RNAi慢病毒的包裝 取對數生長期細胞293T細胞，按照每個10 cm的培養皿6×106個細胞數接種于培養皿中。轉染前2 h將細胞培養基更換為Opti-MEM培養液；取9 μg Packaging Mix和 3 μg慢病毒表達質粒加入 1.5 mL Opti-MEM（經 37℃預熱）中混勻；取 36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中混勻；混合質粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20 min；將3 mL質粒脂質體復合物加入到細胞培養皿中混勻，置37℃，5%CO2的培養箱中孵育6 h后，更換完全培養液DMEM+10%FBS；48 h后收集細胞培養上清，3 000 r/min離心10 min，去除細胞和碎片，并用0.45 μm的濾器過濾；將病毒原液在50 000 g下超速離心2 h，去除上清，重懸于200 μL DMEM培養液中，分裝小管，放置于-80℃下備用。

1.2.3 孔稀釋法測定病毒滴度 測定前1 d，對293T細胞進行傳代，96孔板上每孔加入約8 000個細胞，體積100 μL。將病毒儲存液按梯度稀釋（每50微升中含慢病毒液1×10-3～1×10-8mL），吸去96孔板中原先的培養基，然后在每孔中加入50 μL慢病毒稀釋用培養基，混勻各管慢病毒稀釋液，再各取50 μL慢病毒稀釋液加入到每孔細胞中，每個稀釋度3個重復。繼續放入CO2培養箱中培養。48 h后，每孔加入100 μL新鮮培養液。5～6 d后觀察熒光表達，正常情況下，熒光細胞數隨稀釋倍數增加而相應減少，計數最大稀釋倍數孔中的帶有熒光的細胞個數，病毒滴度（TU/mL）=（熒光細胞個數×轉染時細胞數/100×每孔加入病毒稀釋液體積）×1/稀釋濃度。

1.2.4 熒光定量PCR檢測VEGF表達 以MOI值100浸染人肝癌MHCC97L細胞48 h后收集細胞。按Trizol裂解液說明書進行細胞RNA的抽提；按照逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄：取 1 μg RNA，用 oligodt18 引物，42℃ 60 min，70℃ 5 min進行逆轉錄。VEGF上游引物 5’-ACTGCCATCCAATCGA GACCC-3’，下游引物 5’-TGAGGTTTGATCCGCATAATC-3’。內對照β-Actin上游引物5’-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3’，下游引物5’-GTACTTGCGCTCAGGAGGAG-3’。按實時PCR試劑盒說明配制反應體系，反應置于熒光定量PCR儀中，設定程序：預變性 95℃ 120 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，70℃ 45 s，40個循環；熒光信號實時檢測。以MHCC97-空白組細胞為對照，采用 2－△△CT（CT 代表循環閾值）法計算相對定量。

2 結果

2.1 oligo連接入plenti6.3-MIR測序DNA

測序結果證實oligo已正確連接入plenti6.3-MIR，序列與預期序列完全一致（圖1）。

圖1 oligo連接plenti6.3-MIR測序（部分）

2.2 RNAi慢病毒的包裝

plenti6.3-MIG-200轉染實驗24 h后，在熒光顯微鏡下（×100）同一視野的熒光和可見光照片對比，可見大部分細胞發出熒光（圖2），說明轉染成功。

圖2 在熒光顯微鏡下觀察RNAi慢病毒的包裝（×100）

2.3 RNAi慢病毒滴度測定

根據熒光顯微鏡和普通顯微鏡（×100）下同時觀察plenti6.3-MIG-200病毒感染293T細胞，在熒光顯微鏡下，在加入10-8mL病毒原液的孔中觀察到表達綠色熒光的細胞分別為37、25和 35 個， 則病毒的滴度為：[（37+25+35）TU/3]/1×10-8mL=3.23×109TU/mL。

2.4 熒光定量PCR檢測VEGF表達

RNAi慢病毒對人肝癌MHCC97L細胞的浸染率大于90%（圖3），熒光定量PCR數據結果顯示：MHCC97-200組RNAi慢病毒對VEGF基因的干擾效率達到72.2%（表1）。

圖3 在熒光顯微鏡下觀察plenti6.3-mir-200浸染48 h后效果

表1 熒光定量PCR檢測RNAi慢病毒對VEGF基因的干擾效率

3 討論

RNAi是一種轉錄后基因沉默現象，具有序列特異性的特點，shRNA可被切割為小干擾性RNA（small interfering RNAs，siRNA），大小一般為21～23個核苷酸，以siRNA作為引導序列，與其具有完全互補序列的同源mRNA，具有特異性抑制目的基因表達的功能，并且新產生的siRNA可形成沉默復合物，繼續對mRNA降解，從而產生級聯放大效應[4-5]。由于RNAi技術抑制目的基因表達的效果確切，并且具有穿透性高和級聯式放大效應等特點，因而在基因功能研究中具有很好的應用前景[6]。

慢病毒載體是一種新的病毒載體系統，是在HIV-Ⅰ病毒的改造基礎上形成的，其能夠高效率地向動物或人的細胞系中導入目的基因，慢病毒載體具有明顯的優點，其介導的目的基因可完全整合到宿主細胞的基因組中，發揮基因表達或沉默作用持續并且穩定，并且不隨著細胞的傳代而減弱，從而實現目的基因的長期表達[7]，這一點與目前常見的腺病毒載體、腺相關病毒載體和傳統逆轉錄病毒載體相比具有顯著優勢。當慢病毒載體用于RNAi研究時，不但可以高效抑制目的基因的表達，同時還可以充分發揮其作為病毒載體的自身優勢，是基因功能研究中的有力工具[8-10]。

筆者前期研究發現課題組的原研藥物——參芪扶正注射液，可顯著抑制人肝癌細胞MHCC97L的生長、侵襲能力，并能下調VEGF基因表達，為進一步明確VEGF基因是否是藥物發揮抑瘤作用的關鍵，需要在體內外實驗中實現VEGF基因在人肝癌細胞MHCC97L中“沉默”，以便在VEGF基因沉默狀態下進一步研究藥物抑瘤作用的變化。本研究成功構建了能轉錄產生VEGF shRNA的質粒，進而構建并包裝產生高滴度的慢病毒RNAi載體，并有效整合至人肝癌MHCC97L細胞中，顯著抑制了MHCC97L細胞中VEGF基因的表達，抑制率達72.2%，這將為今后從體內、體外系統研究VEGF沉默對參芪扶正注射液抑瘤作用變化的影響提供可靠的技術平臺。

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