刺參夏眠不同時期劃分以及前腸各組織層厚度定量分析

蘇 琳, 陳慕雁, 王天明, 劉 進, 趙 業, 楊紅生

(1.中國科學院 海洋研究所 海洋生態與環境科學重點實驗室, 山東 青島 266071; 2.中國科學院 研究生院,北京 100049; 3. 中國海洋大學, 山東 青島 266003)

關于刺參(Apostichopus japonicus)消化道組織學和生理特性的研究已有報道[1-5]。正常情況下, 刺參的消化道分為口、咽、食道、胃、前腸、后腸和肛門等部分[6], 消化道基本結構由內到外依次分為黏膜上皮、黏膜下層、肌肉層和外膜4層[1]。進入夏眠后, 刺參消化道基本結構不發生變化, 但是消化道發生退化, 消化道整體變細、變短, 各部分限界變得不明顯, 并且各組織層變薄[2-3]。目前對于刺參消化道組織學的研究主要是通過光鏡或電鏡切片的觀察來進行定性的描述[1-3], 而沒有對各組織層厚度進行定量分析。

在刺參夏眠分期方面, 李潤玲等[2]提出根據刺參夏眠程度的不同, 可分為夏眠初期、中期和末期,但是沒有給出具體的分期標準。李霞等[3]根據刺參消化道和呼吸樹的外部形態和組織結構變化特點, 按照退化程度由淺到深的順序, 將夏眠退化過程科學地劃分為早、中、晚3個階段。

為了更為全面地界定刺參由正常到衰退、再由衰退到恢復的整個夏眠過程中的關鍵節點, 并且更加客觀地描述刺參的夏眠程度, 本實驗將刺參的夏眠細分為夏眠初期、深度夏眠期、夏眠解除期 3個階段, 并對刺參夏眠期間前腸各組織層厚度進行了定量分析。本研究旨在豐富刺參夏眠期間消化道組織學的基礎理論, 為進一步研究刺參夏眠過程提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及取樣

按照下列標準將刺參夏眠階段分為 3個時期:夏眠初期的判斷標準為刺參活動及攝食量明顯減少;深度夏眠期的判斷標準為絕大多數刺參躲進石縫不動不食, 解剖后可發現消化道最粗處不足 1 mm[7];夏眠解除期的判斷標準為刺參開始恢復活動與攝食。活動量大、正常攝食的刺參為非夏眠期刺參, 作為對照組。

實驗刺參取自山東省膠南市刺參養殖池, 按照取樣時間及取樣時刺參腸道的退化程度分為夏眠初期、深度夏眠期、夏眠解除期和非夏眠期刺參, 4個時期的樣品分別于2011年6月24日、8月25日、10月9日和10月28日采集, 海水溫度分別為24、29、20、15℃ 每次取 10 頭刺參, 體質量約 80～100 g。

1.2 光鏡樣品處理及觀察

采捕獲得的刺參進行現場解剖, 截取前腸, 迅速放入 Bouin液固定, 固定 24 h后, 經梯度酒精脫水、透明、浸蠟等過程, 再用石蠟包埋組織, 用切片機連續切片, 切片厚度為6 μm, 再經黏片、烤片、脫蠟、復水、H.E染色、封片等過程, 制成石蠟切片。用 Olympus顯微鏡觀察測量并拍照, 每個刺參樣品隨機選取3張切片, 每張切片隨機選取4個位點測量各組織層的厚度及壁厚, 并隨機測量直徑4次。

1.3 數據分析

計算每個刺參樣品各數據的平均值, 以及各層占腸壁總厚度的百分比, 計算每個時期樣品的平均值和標準差, 并用統計軟件(SPSS Statistics 17.0)進行單因素方差分析, 分析各時期樣品之間的差異顯著性,P＜0.05為差異顯著,P＜0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 夏眠不同階段刺參前腸直徑和前腸壁厚度變化

深度夏眠期刺參前腸的直徑顯著小于對照組(P＜0.01), 其他兩組與對照組無顯著差異(P＞0.05)。夏眠各時期前腸壁厚與對照組之間均無顯著差異(P＞0.05), 夏眠解除期前腸壁厚顯著大于夏眠初期(P＜0.05)和深度夏眠期(P＜0.01)(圖 1, 圖 2)。

圖1 夏眠不同時期刺參前腸直徑和腸壁厚度(μm)Fig. 1 Diameter and thickness of anterior intestine at different stages of aestivating A. japonicus(μm)

圖2 夏眠不同時期刺參前腸的組織學變化Fig. 2 The histological changes of anterior intestine at different stages of aestivating A. japonicus

2.2 夏眠不同階段刺參前腸各組織層厚度的比較

夏眠初期和深度夏眠期刺參前腸黏膜上皮的厚度顯著小于對照組(P＜0.01); 黏膜下層在各時期之間無顯著差異(P＞0.05); 深度夏眠期肌肉層的厚度顯著小于對照組(P＜0.01), 其他時期與對照組相比無顯著變化(P＞0.05); 夏眠初期外膜的厚度顯著小于對照組(P＜0.05), 之后逐步恢復到正常狀態(圖3)。

2.3 夏眠不同階段刺參前腸各組織層厚度占前腸壁總厚度的比例

夏眠初期黏膜上皮厚度占腸壁總厚度的比例顯著小于對照組(P＜0.05), 黏膜下層所占比例則顯著大于對照組(P＜0.01); 深度夏眠期肌肉層所占比例顯著小于對照組(P＜0.05), 同時也顯著小于夏眠初期和夏眠解除期(P＜0.01); 夏眠初期外膜厚度所占比例也顯著小于對照組(P＜0.05), 在深度夏眠期和夏眠解除期與對照組無顯著差異(P＞0.05)(表1)。

圖3 夏眠不同時期刺參前腸各組織層厚度(μm)Fig. 3 Tissue layers thickness of anterior intestine at different stages of aestivating A. japonicus (μm)

表1 夏眠不同時期刺參前腸各組織層厚度占前腸壁總厚度的比例(%)Tab. 1 The proportion of thickness of different layers in anterior intestine wall at different stages of aestivating A. japonicus (%)

3 討論

3.1 刺參夏眠不同時期劃分

本研究主要以水溫、刺參的攝食、活動和腸道內容物的多少為標準, 將刺參夏眠階段分為 3個時期: 夏眠初期、深度夏眠期和夏眠解除期。當夏季水溫升至20～25°C時, 刺參進入夏眠初期, 攝食量和活動量明顯減少, 腸道開始退化, 腸道內容物變少; 當水溫接近 30°C時, 刺參進入深度夏眠期, 停止攝食與活動, 躲進石縫進入休眠狀態, 消化道發生嚴重退化, 各部分已沒有明顯的分界, 消化道最粗處不足 1 mm[7], 并且沒有內容物; 當溫度下降到20～25°C時, 刺參恢復活動與攝食, 消化道也逐步恢復到正常狀態, 腸道內容物開始增多, 此時為夏眠解除期。本研究對刺參夏眠的分期和李霞等[3]稍有不同, 李霞等根據刺參消化道和呼吸樹的外部形態和組織結構變化特點, 按照退化程度由淺到深的順序,將夏眠退化過程劃分為早、中、晚3個階段, 而本實驗將刺參的夏眠周期從進入夏眠到結束夏眠進行了更細致的分區, 開始由正常進入夏眠的時期定為夏眠初期, 夏眠最強烈的時期為深度夏眠期, 由夏眠恢復到正常狀態定義為夏眠解除期。這樣的劃分不僅涵蓋了刺參由正常狀態進入夏眠的過程, 還包括了刺參由夏眠狀態恢復到正常狀態的過程, 將刺參夏眠的幾個關鍵點均包含在內。而李潤玲[2]等的研究則沒有對夏眠的分期進行詳細的界定。

3.2 刺參夏眠不同時期前腸各組織層厚度定量分析

刺參進入夏眠后消化道的基本結構沒有發生變化, 消化道變細, 黏膜上皮和肌肉層的厚度在夏眠期間比非夏眠期顯著變薄, 這與李潤玲[2]等的研究結果一致, 并且黏膜上皮和肌肉層的厚度占整個腸壁厚度的比例在夏眠期間也比非夏眠期顯著小, 分析原因可能是黏膜上皮和肌肉層在食物的消化和吸收中發揮著十分重要的作用, 在刺參進入夏眠以后,消化道的消化與吸收功能發生大幅度的減弱, 負責消化與吸收功能的組織層也會隨之變薄。夏眠初期消化道外膜厚度與對照組相比顯著變薄, 消化道外膜厚度占整個腸壁厚度的比例也比對照組顯著變小,深度夏眠期, 外膜厚度沒有明顯變化, 到夏眠解除期, 外膜厚度略為增厚, 但是沒有顯著差異; 整個夏眠過程中呈現出先變薄后增厚的趨勢。李潤玲等研究發現刺參夏眠后食道的外膜略為增厚而腸道的外膜則無明顯變化。這與我們的研究結果略有差異, 可能是因為夏眠時期不同, 消化道的退化程度也不同,而李潤玲等沒有對夏眠過程中消化道退化進行具體的分期研究。李潤玲[2]等的研究還認為, 夏眠時刺參消化道的黏膜下層變薄, 本實驗數據統計顯示刺參夏眠各階段前腸黏膜下層厚度與對照組無明顯差異(P＞0.05), 但是, 夏眠初期刺參前腸黏膜下層厚度占腸壁厚度的比例比對照組顯著變大(P＜0.01), 這可能是由于黏膜上皮和外膜厚度在夏眠初期比對照組變小, 因此黏膜下層厚度占腸壁厚度的比例會相對變大。

刺參消化道在夏眠期間表現出明顯的退化現象,本研究豐富了刺參夏眠期間消化道組織學的基礎理論, 然而對刺參夏眠期間消化道退化機制的研究有待進一步深入。

[1]崔龍波, 董志寧, 陸瑤華. 仿刺參消化系統的組織學和組織化學研究[J]. 動物學雜志, 2000, 35(6): 2-4.

[2]李潤玲, 丁君, 張玉勇, 等. 刺參(Apostichopus japonicus)夏眠期間消化道的組織學研究[J]. 海洋環境科學, 2006, 25(4): 15-19.

[3]李霞, 王霞. 仿刺參在實驗性夏眠過程中消化道和呼吸樹的組織學變化[J]. 大連水產學院學報, 2007,22(2): 82-85.

[4]孫奕, 陳騳. 刺參體內外微生物組成及其生理特性的研究[J]. 海洋與湖沼, 1989, 20(4): 300-307.

[5]王霞, 李霞. 仿刺參消化道的再生形態學與組織學[J]. 大連水產學院學報, 2007, 22(5): 340-346.

[6]廖玉麟. 中國動物志[M]. 北京: 科學出版社. 1997:334-335.

[7]袁秀堂, 楊紅生, 陳慕雁, 等. 刺參夏眠的研究進展[J]. 海洋科學, 2007, 31(8): 88-90.