測(cè)定葡萄酒中合成著色劑含量的不確定度評(píng)定

單祝庚，楊 靜

（衡陽(yáng)市產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所，衡陽(yáng) 421001）

合成著色劑是為了賦予或改善食品色澤而添加到食品中的物質(zhì)，它不是食品的成分，在著色劑合成中可能伴有其他副產(chǎn)品而造成污染，特別是早期使用的合成著色劑很多發(fā)現(xiàn)具有致癌性，因此世界各國(guó)對(duì)食用合成著色劑都嚴(yán)格控制。目前，我國(guó)允許使用的安全性較高的只有8種。對(duì)合成著色劑的檢測(cè)通常采用國(guó)標(biāo)GB／T5009.35－2003高效液相色譜法。

評(píng)定不確定度已成為各實(shí)驗(yàn)室在實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可、計(jì)量認(rèn)證復(fù)查和樣品比對(duì)工作中的重點(diǎn)，它實(shí)現(xiàn)了統(tǒng)一地評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果的質(zhì)量，在食品添加劑的檢測(cè)工作中具有重要的意義［1－2］。本文對(duì)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定葡萄酒中四種合成著色劑的測(cè)量結(jié)果合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度進(jìn)行了分析和評(píng)定。

1 實(shí)驗(yàn)方法與儀器

1.1 測(cè)量?jī)x器：日本島津LC－10A高效液相色譜儀，SPD－10Avp紫外檢測(cè)器

1.2 測(cè)量環(huán)境條件：30℃，相對(duì)濕度≤55%

1.3 合成著色劑儲(chǔ)備標(biāo)準(zhǔn)溶液：檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃0.500mg／ml，u＝1%（k＝2）（購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）。

1.4 合成著色劑標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：分別移取上述四種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10、0.20、0.40、0.80、1.60mL于10.0mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，配成混合標(biāo)準(zhǔn) 溶 液，濃 度 分 別 為 5.0、10.0、20.0、40.0、80.0μg／mL。

1.5 樣品預(yù)處理：稱取5.0g左右的樣品于100mL燒杯中，水浴加熱驅(qū)除乙醇，按 GB／T5009.35－2003聚酰胺吸附法提取合成色素后蒸發(fā)至近干，加水溶解定容至50.0mL，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，上機(jī)分析［3］。

1.6 色譜條件

1.6.1 色譜柱：Wondasil C18 5μm 4.6 mm×250mm

1.6.2 流動(dòng)相：乙酸銨（0.02mol／L）：甲醇，梯度洗脫20%～35%，3%／min；35%～98%，9%／min；98%繼續(xù)6min；流速：1mL／min

1.6.3 檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm

2 數(shù)學(xué)模型

測(cè)量結(jié)果計(jì)算公式：其中x為試樣中色素的含量（mg／kg）；C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中色素的濃度（μg／mL）；V為試樣處理后定容體積（mL）；m為所稱取試樣質(zhì)量（g）。

試樣中色素濃度C（μg／mL）通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，其公式為：

A－峰面積；C－表示濃度；k－斜率；b－截距。

由公式（1）和公式（2）分析可知四種著色劑不確定度主要來源于標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合、峰面積的測(cè)量、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、樣品處理后定容的總體積，試樣稱樣量等不確定度因素。

3 不確定度分量的計(jì)算及合成

3.1 曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本實(shí)驗(yàn)共選取5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)重復(fù)測(cè)定3次。由于測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)較多，本文選取檸檬黃進(jìn)行不確定的計(jì)算和評(píng)定作為其他著色劑的參照。表1列舉了四種著色劑中檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)峰面積的測(cè)定結(jié)果。

表1 不同濃度著色劑混標(biāo)中檸檬黃峰面積的測(cè)定結(jié)果

以濃度C（μg／mL）為橫坐標(biāo)，峰面積A（mA）為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、相關(guān)系數(shù)分別為A＝68 802C，斜率k＝68 802，γ＝1。

表2 檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)曲線標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算結(jié)果

續(xù)表

表3 四種著色劑的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)偏差s

比對(duì)樣品中檸檬黃7次重復(fù)測(cè)定結(jié)果平均值為53.4 mg／kg，則曲線擬合產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定為：

式中p－樣品測(cè)定次數(shù)；n－標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)；C0－樣品測(cè)定平均值；C－－不同標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均值。其他三種著色劑的不確定度的評(píng)定按照此法計(jì)算，結(jié)果見表4。

表4 其他三種著色劑曲線擬合相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度數(shù)據(jù)

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程量器校準(zhǔn)產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表5 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中量具校準(zhǔn)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由表5數(shù)據(jù)合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.2.3 溫度變化產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

因此，由標(biāo)準(zhǔn)溶液產(chǎn)生的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3 樣品制備引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

3.3.1 樣品稱量產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

稱樣量為5.0g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

3.3.2 定容體積產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品預(yù)處理后轉(zhuǎn)移入50.0mL容量瓶，并用水定容至刻度。其最大允許誤差為±0.0 2mL，按矩形分布考慮，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.3.3 定容時(shí)溫度產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

同3.2.3，其引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為1.21×10－3。

由上述評(píng)定可知，樣品制備引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

3.4 測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

表6 相同實(shí)驗(yàn)條件下，7次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)數(shù)據(jù)

4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度合成：

其中四種著色劑的μ（2）和μ（3）相同，μ（1）和μ（4）數(shù)據(jù)分別見表4和表6，四種著色劑各相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量匯總后得到合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：檸檬黃：1.3%；莧菜紅：1.6%；胭脂紅：1.7%；日落黃：1.8%。

5 擴(kuò)展不確定度

取置信概率95%，包含因子k＝2［5］，以合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子再乘以樣品中各著色劑測(cè)定含量進(jìn)行擴(kuò)展不確定度計(jì)算，比對(duì)葡萄酒中四種著色劑依次為：檸檬黃：1.4mg／kg；莧菜紅：1.1mg／kg；胭脂紅：1.2mg／kg；日落黃：1.7mg／kg。

6 測(cè)量不確定度報(bào)告

比對(duì)葡萄酒中四種著色劑的測(cè)量結(jié)果為：檸檬黃：（53.4±1.4）mg／kg；莧菜紅：（34.2±1.1）mg／kg；胭脂紅：（34.9± 1.2）mg／kg；日落黃：（46.2±1.7）mg／kg。

7 結(jié) 論

通過對(duì)液相色譜梯度洗脫法同時(shí)測(cè)量葡萄酒中四種著色劑含量的不確定度來源進(jìn)行分析，并對(duì)其不確定度分量進(jìn)行評(píng)定，得出該分析方法的測(cè)量不確定度。同時(shí)可以看出，HPLC法測(cè)定著色劑含量不確定度主要來自標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合、標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備、樣品處理操作過程、儀器的校準(zhǔn)和測(cè)量重復(fù)性。因此，在測(cè)試樣品時(shí)，必須嚴(yán)格按照操作規(guī)范，并且使用合格的計(jì)量器具，盡量減小測(cè)量結(jié)果的不確定度，保證檢測(cè)結(jié)果的質(zhì)量。

［1］楊小寧，郭靚，但德忠 .環(huán)境監(jiān)測(cè)中儀器分析方法不確定度的評(píng)估（Ⅱ）：原子吸收光譜分析中的測(cè)量不確定度［J］.四川環(huán)境，2007，26（5）：24－29.

［2］蔡秋，朱明 .高效液相色譜法測(cè)定茶飲料中苯甲酸結(jié)果不確定度評(píng)定［J］.食品科學(xué)，2007，28（2）：277－280.

［3］周小新，周紅 .離子色譜法測(cè)定水中溴酸根離子含量不確定度評(píng)價(jià)［J］.職業(yè)與健康，2009，25（17）：1827－1829.

［4］杜淑霞.高效液相色譜法測(cè)定乳飲料中安賽蜜含量的不確定度評(píng)定［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31（2）：142－146.

［5］劉燕，陳國(guó)利，彭新凱，等.氣相色譜法測(cè)定果凍中甜蜜素結(jié)果不確定度評(píng)定［J］.食品與機(jī)械，2008，24（2）：111－113.