北方寒地草場中主栽苜蓿品種高效共生根瘤菌的篩選

楊旭升，馬志軍，郭春景

（1.黑龍江省科學院，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江省科學院大慶分院，黑龍江大慶163316）

生物固氮每年為全球提供絕大多數的的氮素營養，其中大約80%是由共生固氮生物所固定的，而根瘤菌與豆科植物共生固氮是固氮作用最強的體系[1～3]。豆科牧草以其營養價值高，適口性好，有著很高的經濟價值，在全世界范圍內得到廣泛種植，許多國家都以苜蓿作為重要的農牧業支柱作物。研究結果表明，在土壤氮素營養成分相同的條件下，一種根瘤菌并不能使不同苜蓿品種獲得同樣的接種效果，對一個苜蓿品種可以產生良好固氮效果的菌株，對另一苜蓿品種可能固氮效果一般，這種固氮效果的差異現象，說明根瘤菌與寄主植物之間需要很好的匹配，才能使苜蓿獲得最佳的接種固氮效果[4～7]。陳文新院士等經過二十多年的研究，提出了有關根瘤菌與豆科植物共生關系的結論：同一種植物在不同生態環境中可與不同根瘤菌結瘤固氮，同一生態環境條件下不同植物可與同一根瘤菌共生固氮。因此，進行根瘤菌接種劑選種時，必須針對種植的生態環境及寄主植物兩方面的因素，來選擇與苜蓿最佳匹配的根瘤菌，而不是只考慮與寄主的匹配，并認為過去研究生物固氮只考慮與寄主植物的關系，很可能是接種效果不穩定的一個重要原因[8～12]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試的紫花苜蓿品種

巨人201苜蓿,金皇后苜蓿,馴鹿苜蓿,肇東苜蓿和敖漢苜蓿,共5個北方寒地草場中主栽的苜蓿品種,由黑龍江省科學院生物肥料研究中心保藏、提供。

1.1.2 供試的苜蓿根瘤菌菌種

SM29，SM30，SM32，SM33，SM35，SM36，SM37，SM38，SM39，SM40，SM41，共 11株，由黑龍江省科學院生物肥料研究中心保藏、提供。

1.1.3 供試蛭石

由河北靈壽源通礦產品加工廠生產。

1.1.4 試驗用低氮營養液配方

0.03 g Ca (NO3)2，0.15g Na2HPO4，0.1g CaCl2·2H2O，0.12g MgSO4·2H2O，0.10g KH2PO4，0.05g 檸檬酸鐵和 1 mL 微量元素(配方：2.86g H2BO3，1.81g MnSO4，0.80g CuSO4·5H2O，0.02g H2MoO4,1L 蒸餾水)。拌勻蛭石后，把蛭石裝入耐高溫的塑料杯中，連同供水系統在121℃條件下滅菌3h，獲無菌蛭石。

1.1.5 根瘤菌YMA培養基

10g 甘 露 醇 ，0.25g K2HPO4，0.25g KH2PO4，0.2g MgSO4，0.1gNaCl，3gCaCO3，lL 蒸餾水，固體另加 1.5g瓊脂粉，pH值6.8～7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養及種子的催芽

將供試菌株分別接種到克氏瓶中YMA培養基平面上，28℃培養36h，用大約100mL無菌水洗下菌體，裝入無菌三角瓶中，旋渦振蕩打散菌體后,取一部分測其OD值 (600 nm)，使每毫升菌懸液中根瘤菌數量達20億個。苜蓿種子經95%乙醇處理15min，用無菌水沖洗5～8次，再用0.1%的HgCl進行表面消毒4min之后,用無菌水沖洗7～8次,分別用沙皿法在28℃下催芽。

1.2.2 蛭石栽培及接種

取l培養皿加入1種備用的菌懸液適量 (以淹沒種子為宜)再加入發芽一致、芽長約1cm的1種苜蓿種子,浸泡15min,用無菌鑷子夾取植入裝有無菌蛭石的塑料杯中，每杯種植4顆，再沿各植株根部加入該菌液2 mL，使每個處理中含菌量達到40億個,中苜l號、RS分別用10種不同根瘤菌進行接種處理，Vector、WL323分別用8種不同根瘤菌進行接種處理，各個處理設3個重復，各品種(或品系)以不接菌作為空白對照，同樣設3個重復。以上操作均在無菌操作臺上進行，最后轉入光照強度為9000Lx，白天溫度為(23±5)℃，晚上溫度為(18±2)℃，日照時數16 h的溫室中培養。

1.3 接種效果的測定

待植物生長到45d后進行收獲。收獲時把根用水洗干凈，分別測定每株植物的有效根瘤數(以呈現粉紅色為標準)、總根瘤數、植物地上部分干重(以第1片子葉葉痕處作為劃分標準，苜蓿樣品在80℃烘干到恒重后稱其干重)。計算出單株的平均有效根瘤數、平均總根瘤數和地上部分平均于重，進行數據分析和處理。

2 結果與分析

我們進行了所選用的苜蓿根瘤菌菌株（11株）與我們所選用的在黑龍江省大面積栽培的苜蓿品種（巨人201，金皇后，馴鹿，肇東苜蓿，敖漢）進行最佳共生匹配的雙瓶試驗，試驗結果見表1-5。

從表1的試驗結果中可以看出，接種SM32、SM33、SM35、SM39和SM41的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結瘤數、瘤干重和植株地上部分干重等幾個考察的生物學指標中明顯地優于接種其它幾個菌株的苜蓿植株。

表1 苜蓿根瘤菌與巨人201苜蓿最佳共生配對試驗結果Table 1 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with the Juren 201

表2 苜蓿根瘤菌與金皇后苜蓿最佳共生配對試驗Table 2 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Golden Empress alfalfa

從表2的試驗結果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM33、SM35、SM40 和 SM41 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結瘤數、瘤干重和植株地上部分干重等幾個考察的生物學指標中，明顯地優于接種其它幾個菌株的苜蓿植株。

從表3的試驗結果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM35、SM38 SM341、和 SM39 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結瘤數、瘤干重和植株地上部分干重等幾個考察的生物學指標中明顯地優于接種其它幾個菌株的苜蓿植株。

表3 苜蓿根瘤菌與傲寒最佳共生配對試驗Table 3 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Aohan

表4 苜蓿根瘤菌與馴鹿苜蓿最佳共生配對試驗Table 4 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with reindeer alfalfa

從表4的試驗結果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM33、SM35、SM39 和 SM41 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結瘤數、瘤干重和植株地上部分干重等幾個考察的生物學指標中，明顯地優于接種其它幾個菌株的苜蓿植株。

從表5的試驗結果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM35、SM39、SM40 和 SM41 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結瘤數、瘤干重和植株地上部分干重等幾個考察的生物學指標中明顯地優于接種其它幾個菌株的苜蓿植株。

表5 苜蓿根瘤菌與肇東苜蓿最佳共生配對試驗Table 5 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Zhaodong alfalfa

比較5組試驗數據結果，證明在供試的11個苜蓿根瘤菌菌株中，SM32、SM35 、SM39、SM41 這四株苜蓿根瘤菌與我省寒地草場中廣泛栽培的具有代表性的5個苜蓿品種進行的共生匹配試驗中，均表現出了良好的固氮結瘤效果，接種它們的苜蓿在株高、葉色、結瘤數和植株地上部分干重等指標上，均明顯地優于接種其它的根瘤菌菌株的植株，根據上述的研究結果，我們篩選出了 SM32、SM35 、SM39、SM41 這四個與我省寒地草場中主栽的苜蓿品種最佳共生匹配的苜蓿根瘤菌菌株。

3 結 論

苜蓿作為一種適種于荒漠、干旱、貧瘠地區的先鋒植物，能很好地適應我國北方寒地草場地區的自然環境。當前正在進行的退耕還林還草工程，需要大面積種植豆科灌木和牧草，接種根瘤菌是解決大面積人工林場、草場“氮素營養缺乏”問題的有效途徑[13～15]。因此，研究苜蓿與根瘤菌之間的最佳共生匹配關系，使苜蓿獲得最佳固氮效果，大力推廣根瘤菌接種技術，不僅可以改善北方寒地草場地區的土壤微生態環境，而且還可以推動該地區的畜牧業的發展。所有根瘤菌并不能使同一苜蓿品種獲得同樣的接種效果，只有根瘤菌與寄主植物具有很好的匹配性，才能獲得最佳的共生結瘤固氮效果。本文進行了北方寒地草場中主栽的5個紫花苜蓿品種分別接種11株不同的根瘤菌在溫室條件下的最佳共生匹配試驗，從中篩選出了與不同紫花苜蓿品種具有最佳結瘤固氮效果的根瘤菌，為最終用于苜蓿栽培生產，提高苜蓿產量和品質，以及豆科牧草接種根瘤菌篩選高效菌株，建立起一套行之有效的根瘤菌選種技術方法[16，17]。

[1]康麗華,李素翠.相思苗木接種根瘤菌的研究[J］.林業科學研究，1998，1l(4)：343～349.

[2]中國草原學會.中國草地科學進展(第四屆第二次年會暨學術討論會文集)[G］.北京：中國農業大學出版社，1998,132～135.

[3]馬其東，劉自學，洪紱曾,等.不同根系發育能力的苜蓿品種接種根瘤菌的效果[J］.草業學報，1999,8(4)：36～45.

[4]寧國贊，劉惠琴，子曉彤.生物固氮技術在退耕還林還草中的應用[J］.中國草地，2001，23(4)：69～72.

[5]馬興祥，劉明春，尹東.祁連山草原氣候和草地資源開發利用[J］.草原與草坪,2000，3：37～39.

[6]周敏.中國苜蓿栽培史初探[J］.草原與草坪，2004，1：44～46.

[7]胡自治.人工草地在我國21世紀草業發展和環境治理中的重要意義[J］.草原與草坪,2000，1：12～16.

[8]張志芳.利用根瘤菌提高紅豆草根瘤菌能力的研究[J］.草業科學，1996.13(6)：45～47.

[9]魯鴻佩，孫愛華，張榕，等.寧夏地區紅豆草紫花苜蓿與無芒雀麥混播接種根瘤菌效果的試驗報告[J］.中國草食動物，1999，(專輯)24～25.

[10]王志明，岳民勤.紫花苜蓿根瘤菌接種劑量的試驗初報[J］.中國草食動物，2000，(專輯)30～31.

[11]喻文虎,張志芳.紅豆革紫花苜蓿根瘤菌接種研究[J］.草業科學，1995，12(3)：22～26.

[12]沈世華，荊玉祥.中國生物固氮研究現狀和展望[J］.科學通報，2003，48(6)：532～540.

[13]林稚蘭，黃秀梨.現代微生物學與實驗技術[M］.北京：科學出版社，2000.9～13.

[14]曾昭海.紫花苜蓿高效根瘤菌篩選及田問鑒定方法研究[D］.中圍農業大學博十學位論文，2003.

[15]寧同贊，劉慧琴.中國豆科牧草根瘤菌資源的采集寶藏及利用[J］.草地學撤,1999，7(2)：165～172.

[16]陳丹明，曾昭海，隋新華,等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的篩選[J］.草業科學，2002，19(6)∶27～3l.

[17]陳文新，李阜棣.我國土壤微生物學和生物同氮研究的回顧與展望[D］.院士論壇,世界科技研究與發展.2002，4：6～12.