根霉紫外誘變菌株的性能及其發酵制作臘八豆的研究

孫繼民 ，魏寶陽 ，譚炎寧 ，張逸妍 ，羅尊長 ，黃鳳球

（1.湖南省土壤肥料研究所，湖南 長沙 410125；2.湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128；3.湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；

4.國家雜交水稻工程技術研究中心，湖南 長沙 410125）

臘八豆是我國傳統發酵豆制品之一，它富含蛋白質、氨基酸和維生素，營養豐富，易于消化吸收，滋味鮮美，倍受人們喜愛；并且研究發現它具有大豆異黃酮、大豆多肽等功能性成分，有利于人們的健康[1-2]。傳統方法制作臘八豆，是在自然環境條件下發酵釀制而成，可能產生黃曲霉毒素B1等有毒物質，還存在季節性強、生產周期長等問題。湖南農業大學微生物教研室于1997年首次利用毛霉菌M2為菌源，人工接種，人工調控發酵，在春季進行臘八豆產品的研制和生產試驗。此法縮短了臘八豆的生產周期，擴大了生產量，取得了工業化生產的成功，為傳統臘八豆的工業化、規模化、商品化生產奠定了基礎[3-5]，但在發酵過程及臘八豆產品品質方面仍有些不盡如人意的地方。為適應市場需求，降低臘八豆生產成本，節省能源，需要選育出發酵性能高、能在中低溫下快速發酵的菌株。紫外誘變是一種常規有效的菌株誘變育種方法，且操作簡便，歷年來的試驗表明，80%的有效誘變是通過紫外誘變獲得的。因此本研究以品質優良的高溫根霉菌株8為出發菌株，經紫外線誘變，獲得一生長性能良好、具有廣溫特性的菌株1。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 菌 種 8號菌株，湖南省土壤肥料研究所實驗室保存。

1.1.2 儀 器 100套培養皿，若干支10 mL移液管，若干支1.0 mL移液管，100 mL錐形瓶若干個，250 mL錐形瓶若干，量筒，紗布，接種環，酒精燈，玻璃刮鏟，紅光燈，紫外燈，滅菌鍋，恒溫培養箱，磁力攪拌器，分光光度計。

1.2 培養基

菌株的培養選擇馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA培養基）。

1.3 試驗方法

1.3.1 出發菌株的選育 菌株選擇主要結合產品的色、香、味、形，一般要求它生長速度快、不產生有害物質、培養方便、酶系復雜（不僅含蛋白酶，還含有其他酶類），且酶活性高、發酵速度快，菌種純、性能穩定，產品風味好。生產菌株8符合以上要求，可作為出發菌株。

在無菌操作下將試管根霉菌原菌株制成孢子懸浮液，并用無菌毛細管取孢子懸浮液點滴到無菌平板表面，每皿1～5滴，反轉倒置于25～28℃溫箱中培養24～72 h，每隔6 h觀察1次，選取生長速度快、菌絲健壯、色澤一致、孢子形成快的單個菌落，挑取少許菌絲移入無菌試管斜面培養基上，在25～28℃恒溫箱中培養4～5 d后，置冰箱內備用。

1.3.2 紫外光誘變 首先是在無菌條件下，從選好的臘八豆菌株中，用接種環挑取一定量孢子，放入無菌水中，震蕩10 min左右；再用移液管移取該種菌液10 mL放入已滅菌的空白培養皿中。然后利用紅燈照明和紫外光誘導，誘變時間分別為10、30、60、90、120、180、240 s，接種完畢用已滅菌玻璃刮鏟涂勻，將培養皿放在黑暗和室溫條件下培養3 d。1.3.3 菌株的篩選 將以上誘導各個時段生長良好的菌株，在無菌條件下，將這些菌和出發菌株分別接種到平皿培養基上，放置在室溫下培養，仔細觀察比較，選出優良菌株1。

1.3.4 淀粉酶活性測定 先配好淀粉培養基，再通過較高溫滅菌后，快速倒好平板，制成淀粉酶培養皿。在無菌條件下，將1和8這兩個菌的孢子分別接種在淀粉培養基上。每12 h觀察一次，比較其生長速度、菌圈的大小。

1.3.5 氧氣含量對菌株生長的影響 分別將誘變菌株1和出發菌株8接種在含大豆的水溶液和不用水泡的濕大豆中，置30℃溫度條件下培養3 d，觀察是否有菌絲生長及菌絲的生長量（每50 g干大豆所得干菌絲的重量）。

1.3.6 菌株遺傳穩定性試驗 將誘變所得菌株于真菌培養基上連續培養八代后，將之接入相同量煮熟的大豆上，比較第一代與第十代菌種在煮熟的50 g大豆（干重）、溫度為20℃、培養時間3 d的菌絲生長速度和形成氨基酸的量。

1.3.7 氨基酸含量的測定 用出發菌株8和誘導菌1作對照試驗放入28℃恒溫箱中培養6 d，讓其萌發長菌。制成臘八豆后，測其氨基酸含量。氨基酸中的自由氨基與水合茚三酮共熱，產生紫色化合物，在一定范圍內其顏色的深淺與氨基酸的含量成正比，該有色物質在570 nm下有最大吸收。再用紫外光分光光度計測定未知樣品中的氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 紫外誘變試驗

2.1.1 紫外線誘變劑量的確定 選育了一株能在高溫下（38℃）生長速度快、蛋白酶活性較高、菌絲粗壯，并處在相同生長期的優良菌株8，作為出發菌株，進行紫外線誘變。

試驗選擇 30、60、90、120、240 s等不同時間對孢子懸液進行紫外線照射，結果（如圖1）顯示，劑量為30 s的誘變，因存活率高、誘變率低、菌苔多，不易找到誘變株；劑量為240 s的誘變即使正變率較高，但它的存活率較低，所以都不宜選用。經過多次紫外線誘變試驗發現，以稍高劑量進行紫外線誘變有利于獲得目的菌株。在距離30 cm時，照射時間以120 s為佳；通過多次試驗證明，此劑量是最佳誘變劑量，效果最好。

圖1 紫外線照射時間與孢子死亡率的關系

2.1.2 紫外誘變結果 選取分別標記為：2′—01，2′—02，2′—03，2′—04，4′—01，8′—01，8′—02 的誘變菌株進行比較試驗，發現2′—01在較低溫度下，生長速度（以滿管時間表示）和菌絲粗壯程度均優于其他菌株。因此，以該菌株作為目的菌株，命名為誘 1，見表 1。

表1 不同溫度條件下誘變菌株的生長比較

2.2 淀粉酶活性測定結果

接種培養后，培養基上有菌株生長，原始菌株的淀粉酶活性為72.21 U/g，紫外線誘變后誘-1的71.76 U/g，說明它們都含有淀粉酶；誘變前后菌株的淀粉酶活性并無顯著增加或減少，表明紫外線在誘變過程中并未引起形成淀粉酶基因發生改變。

2.3 氧氣對菌株的影響

試驗結果顯示：菌株誘變前后在水中（缺氧條件）的生長遠不及在空氣中（有氧條件）生長得快、好；它們雖然都能在水中生長，但其生長量和生長速度明顯受氧氣的制約。這說明菌株在誘變前后都是好氧菌，氧氣不足將直接影響菌株的生長發育，所以在生產過程中要注意保持氧氣的持續供應。

表2 氧氣對菌株生長發育的影響

2.4 誘變株的遺傳穩定性

通過多次傳代培養試驗，發現在較低溫和室溫的條件下，誘1的長勢要明顯優于出發菌株8；在出發菌株8不生長的條件下，誘變菌株能很好地生長、發育和成熟。說明誘1的這種能在較低溫下生長的性狀是可以穩定遺傳的，見表3。

表3 誘變株的遺傳穩定性

2.5 臘八豆氨基酸含量的測定

將分別培養3 d和6 d的臘八豆稱量、磨碎、定容、過濾，然后用可見光分光光度計測得氨基酸含量，結果表明：用出發菌株發酵3 d和6 d后的臘八豆的氨基酸含量分別為1.178 mg和1.578 mg；用誘導菌株發酵3 d和6 d后的臘八豆的氨基酸含量分別為5.814 mg和17.54 mg。可見誘變后菌株不僅溫度適應性強，而且它的蛋白酶活性也得以提高，用其發酵，制作的臘八豆品質也將有較大提高。

3 討論

民間傳統方法是無法大量生產臘八豆的，因為毛霉的最適生長和發酵的溫度很低，而夏季溫度高，且自然環境中其他微生物的種類和數量是一年中最多的，同樣也是它們生長繁殖最旺盛的季節。然而通過對根霉的紫外線誘變，選育出了誘變菌株1，并與出發菌株在相同條件下進行對比試驗，發現誘變菌株在較低溫度下，能夠保持穩定的較快生長速度，同時，誘變菌株可以更好地分解黃豆中的蛋白質使蛋白質的轉化率升高，大大提高了臘八豆的營養價值。這樣，有利于臘八豆的工業化生產，并為其工業化生產提供了更為經濟、實用、方便的優良菌株。從微生物生態、生物學特性筆者發現，發酵前期主要是根霉菌體的生長和蛋白酶形成，發酵后期主要利用根霉分泌蛋白酶使蛋白質分解為各級肽類、氨基酸。由于根霉產生的淀粉酶在后發酵時能夠將黃豆中少量的碳水化合物分解成低分子物質，增強了臘八豆的風味，改善了臘八豆的品質，且根霉的發酵溫度較高，避免了臘八豆生產的季節限制，提高勞動生產率及設備利用率。利用根霉代替毛霉發酵制作臘八豆從工藝上是完全可行的，同毛霉比有其更大的優勢。誘變菌株1是廣溫菌，可以克服出發菌株的高溫生長特性，更加有利于臘八豆的工業化生產。

如果能利用好根霉和毛霉各自的優點，用純種根霉與純種毛霉共同發酵，這樣可能得到的臘八豆風味更好，營養價值更高；利用誘變菌株1生產臘八豆是否對臘八豆有其他方面的影響，還有待于進一步研究。

[1]鄔玉香，夏延斌，劉愛玲.大豆異黃酮在臘八豆生產中的穩定性[J].湖南農業大學學報，2002，（3）：237-238.

[2]潘志芬，潘開文.加工對大豆異黃酮的影響[J].食品研究與開發，1999，20（1）：38-39.

[3]錢存柔，黃儀秀.微生物學實驗教程[M].北京：北京大學出版社，2000.

[4]杜秉海.微生物學實驗[M].北京：北京農業大學出版社，1997.

[5]夏巖石，夏延斌，蔣立文，等.利用毛霉與根霉共生發酵生產臘八豆的研究[J].食品工業科技，2005，26（1）：96-98.