擬南芥中熱脅迫相關microRNA的差異表達

馮靜弦，汪啟明，胡 琪，饒力群

（湖南農業大學生物化學與分子生物學研究室，湖南 長沙 410128）

在高級真核生物的基因組中，大部分的轉錄產物是非編碼RNA，僅不到3%的基因編碼蛋白質[1]。microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于植物、動物、藻類，以及其他一些單細胞生物和DNA病毒中的非編碼小分子RNA，在進化上具有高度保守性并且能在翻譯水平調控基因的表達。miRNA是由細胞核內的pri-miRNA經Drosha RNase將其切割成具有回文結構的RNA前體（pre-miRNA），再經過Dicer酶加工后生成一種大小約21～23個堿基小分子成熟的miRNA[2-3]。在植物中，miRNA通過堿基互補配對的方式識別靶mRNA，并根據互補程度的不同來指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯[4-5]。最近的研究表明miRNA參與各種各樣的調節途徑，包括激素調節、生長發育、信號轉導以及逆境環境的適應能力等[6-8]。大量研究結果表明，在植物中，干旱、鹽堿、冷害、高溫等非生物脅迫，能夠影響基因在植物內轉錄及轉錄后水平的表達調控[9]。高溫是一種限制植物生長和分布的重要自然災害之一[10]。近年來的研究發現，miRNA作為一種調控因子參與到植物響應外界脅迫的過程中。當miRNA響應高溫脅迫的調控時，其表達量會升高，進而下調其靶基因，這些靶基因可能是逆境脅迫的負調控子，從而達到幫助植物度過逆境的作用。2004年Sunkar等構件了經高鹽、干旱、冷和ABA處理的擬南芥小RNA庫，發現26個新miRNA以及一些miRNA能受到非生物逆境脅迫的誘導。對于不同的植物、不同的植物組織和器官，應當選擇不同的提取方法，因此，筆者以擬南芥葉片為材料選擇了3種常用的提取方法并加以改進，比較其提取效果。只有提取到質量高完整性好的總RNA，才能確保半定量RT-PCR準確檢測到熱脅迫相關基因表達量，從而真實反映起始模板中基因表達量的差異[11]。本研究在生物信息學的基礎上通過半定量RT-PCR技術篩選到4個與熱脅迫相關的miRNA。半定量RT-PCR技術是近年發展起來的探討基因轉錄水平的有效手段[12]。此方法的原理是在PCR體系中加入內對照系統，將樣本間的模板質量和擴展效率調整到同一水平，即利用相同量的RNA進行反轉錄以及PCR擴增，然后通過電泳檢測擴增產物的表達量的差異，可為進一步研究擬南芥熱脅迫相關miRNAs的表達機制及其響應熱脅迫誘導的作用過程提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試材料為湖南農業大學生物科學與技術學院生物化學與分子生物學實驗室提供的Col-4野生型擬南芥，將擬南芥置于38℃的光照培養箱中分別處理 0、0.5、1、2、4 h 后，取其葉片，-80℃保存。

1.1.2 儀 器 Eppendorf高速冷凍離心機、PCR儀、紫外分光光度計、電泳儀、電泳槽、凝膠成像分析儀、電子天平（1/1 000 g）

1.1.3 試 劑 焦碳酸二乙酯（DEPC）One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit與PMD18-T載體試劑盒均為Takara產品；Trizol試劑為invitrogen產品；Taq DNA聚合酶為賽博產品；提取液1：2%CTAB，100 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0），1.5 mol/L NaCl，0.20 mmol/L EDTA（pH=8.0），1%β-mercaptoethanol，5%PVP；提取液 2：50 mmol/L of Tris-HCl（pH=9.0），100 mmol/L NaCl，1%SDS，5%PVP；Li－Cl；氯仿/異丙醇（24∶1）；氯仿；異丙醇；水飽和酚；無水乙醇。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 引物采用PrimerPremier 5.0軟件設計，由華大基因公司合成，miRNA引物及相關引物序列如表1所示。

表1 miRNA引物及相關引物序列

1.2.2 擬南芥總RNA的提取 分別稱取0.1 g新鮮擬南芥葉片，放入液氮預冷過的研缽中，迅速將材料研磨成粉末（研磨的過程中要不斷補充液氮），轉移到一個預冷的1.5 mL離心管中。

（1）改良CTAB法：向離心管中加入0.5 mL提取液 1，劇烈振蕩混勻，65℃溫浴 20 min，4℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液轉移到新的離心管中，加入等體積的氯仿/異丙醇（24∶1）振蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液加入1/2體積氯仿振蕩混勻，4℃、12 000 r/min離心10 min；取上清液，加入1/4體積8 mol/L的LiCl，-80℃沉淀過夜，4℃、12 000 r/min 離心 20 min；棄上清液，加入75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心 5 min；超凈工作臺上風干乙醇，用30 μLDEPC水溶解。

（2）改良的熱酚法：向離心管中加入0.4 mL預熱的水飽和酚，0.6 mL RNA 提取液 2，0.05 mL β-巰基乙醇，振蕩混勻后，冰浴10 min；加入0.4 mL氯仿，劇烈振蕩混勻，室溫靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積的氯仿/異丙醇（24∶1），混勻后冰浴 10 min，4℃、12 000 r/min離心 10 min，加入 1/4體積 8 mol/L LiCl，-20℃沉淀3 h，加入75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min；超凈工作臺上風干乙醇，用30 μL DEPC水溶解。

（3）Trizol提取法：向離心管中加入1 mL Trizol，劇烈振蕩混勻，在冰上靜置15 min，4℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液轉移到新的離心管中，加入200 μL氯仿，劇烈振蕩15 s，冰上靜置15 min，4℃、12 000 r/min 離心 15 min；取上清液約 400 μL到新的離心管中，加入400 μL異丙醇，輕輕混勻，-20℃沉淀 0.5 h，4℃、12 000 r/min離心 10 min；加入75%乙醇洗滌沉淀，4℃、7 500 r/min離心5 min；超凈工作臺上風干乙醇，用30 μL DEPC水溶解。分別取4 μL上樣，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，用紫外分光儀檢測OD260/OD280值，如果結果在1.9～2.0時，說明提取的總RNA質量較好，可以進行下一步試驗。

1.2.3 半定量RT-PCR 采用Takara公司的One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒給miRNA加A尾后進行逆轉錄，PCR反應引物一條由試劑盒提供的通用引物（Uni-miR qPCR Primer），一條自行設計的特異性引物，完成半定量RT-PCR反應（以β-actin作為內參基因）。RT反應體積為 20 μL，先加入 1 μL 總 RNA，再加入 10 μL 2 ×miRNA Reaction Buffer Mix，2 μL 0.1%BSA，2 μL miRNA PrimeScript RT Enzyme Mix，用 DEPC水補足至 20 μL，混勻后 37℃反應 60 min，85℃ 5 s終止反應。

反轉錄結束后，取1 μL cDNA進行PCR反應。PCR 反應體積為 25 μL，1 μL 模板，1 μL dNTP，2.5 μL Buffer，0.5 μLUni-miR qPCR Primer，0.5 μL 特異性引物，0.5 μL Taq 酶，用水補足至 25 μL。反應程序為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 20 s，miR414、miR415、miR837-5p 25 個循環，miRf10564-akr 28個循環，最后72℃延伸10 min。

用含EB（0.5 μg/mL）的2%的瓊脂糖凝膠在電壓100 V下電泳檢測RT-PCR產物。在凝膠成像儀下觀察miRNA在不同時間熱處理下的表達情況。1.2.4 PCR產物的克隆與測序 利用苯酚氯仿抽提的方法回收DNA片段。與PMD-18T載體連接，然后轉化大腸桿菌感受態細胞。通過藍白斑篩選鑒定PCR陽性克隆，測序工作委托華大基因公司完成。

2 結果與分析

2.1 總RNA的提取

OD260/OD280的比值可以確定樣品的純度，提取樣品OD260/OD280的比值越接近2.0，說明RNA的純度較高，樣品提取得好，可以進行后續試驗；當比值低于1.7，所得RNA不可用，需重新提取。改良CTAB法、Trizol法、改良熱酚法的OD260/OD280比值分別為 1.56、1.93、1.96，RNA 平均產量分別為480、1 980、300 μg/mL。Trizol法和改良熱酚法的OD260/OD280比值均在1.9到2.0之間，但是改良的熱酚法所得總RNA的產量過低。瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果顯示，28 S和18 S的條帶都比較清晰，并且28 S的條帶亮度約為18 S亮度的兩倍（圖1），改良的CTAB法沒有提取到高質量的RNA，電泳檢測結果顯示有明顯的拖帶，所以Trizol法是最適合的提取方法。

圖1 總RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結果

2.2 半定量RT-PCR檢測miRNA表達差異

在總RNA逆轉錄時同時進行加poly-A法，可以在一次逆轉錄后獲得所有的miRNA對應的cDNA。其原理是在成熟的miRNA的3′端加上一個poly-A尾巴，這樣Oligo-dT（逆轉錄引物）就很容易結合到mRNA上來合成cDNA，一次逆轉錄反應就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA對應的cDNA。PCR反應過程中，5′端的反向引物為逆轉錄試劑盒中提供的 Universal Adapter Primer，3′端的為自行設計的miRNA Specific Forward Primer。

以擬南芥中成熟葉片經過不同時間熱處理后的總RNA為模板，逆轉錄后采用β-actin作為內參基因，采用表1中的引物對擬南芥中miR414、miR415、miR837-5p和miR10546-akr進行半定量RT-PCR檢測，通過比較條帶亮度的差異來分析4種miRNA在38℃不同時間的熱處理下的表達差異。從電泳條帶的亮度上可以看出（圖2），擬南芥中 miR414、miR415、miR837-5p 和 miRf10546-akr這 4 個基因在 38℃分別熱處理0、0.5、1、2、4 h 后的表達差異。

圖2 熱脅迫處理不同時間下擬南芥中miRNA的表達情況

隨著 38℃處理時間的延長，miR414、miR415、miR837-5p和miRmiRf10546-akr的表達量總體均呈現逐漸增加趨勢。miR414在0.5 h處理后就出現了明顯的表達量增加的情況，miR414的每個處理時間的表達量都明顯高于miR415、miR837-5p和miRmiRf10546-akr；miR837-5p 在處理 0.5、1 h 時沒有很明顯變化，但在處理2 h后其表達量出現顯著的提高；miR415和miRmiRf10546-akrr在處理0.5、1、2 h后都沒有很明顯的表達量的提高，但在4 h后出現表達量的明顯提高。miR414、miR415、miR837-5p和miRmiRf10546-akrr在 38℃熱處理不同時間后其表達量都有提高，未處理的對照和熱脅迫處理不同時間下的表達差異，可能說明它們的表達與植物抗熱機制存在一定的關系，即其相關靶基因在熱脅迫下有相對不同的調節。

3 討論

在動植物表達分析中，常常用到的是實時定量PCR、Northern blot、基因芯片等半定量技術，但這些方法費時費力，且需要特殊的儀器，而半定量RT—PCR技術操作相對簡便，近年來被廣泛地應用于此類研究中[13-15]。近年來，國外的研究人員針對miRNA的長度僅20～23個核苷酸，分別采用了連線性接頭或者設計莖環引物等方式在動植物組織中檢測到miRNA的表達[16-18]。石艷麗等[19]用半定量RT－PCR法測定鏈球菌透明質酸合酶mRNA的水平，這對于深入探討透明質酸發酵有重要意義。筆者運用半定量RT-PCR的方法檢測了擬南芥4個miRNA的表達受到熱脅迫的誘導情況，結果表明在38℃不同時間處理下各個miRNA的表達情況都有差異，并隨著處理時間的延長，其表達量均出現明顯提高。

綜上所述，半定量RT-PCR技術能夠檢測到基因顯著的水平表達變化，該方法在各個研究領域都有著非常廣泛的應用，隨著該技術的日趨成熟和完善，它將成為研究者有力的研究手段。

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