抗煙草花葉病毒病藥用植物篩選及提取物復配增效研究

劉宏松 ，陳麗鵑 ，周冀衡

（1.湖南農業大學煙草研究院，湖南 長沙 410128；2.昆明市官渡區煙草公司，云南 昆明 650200）

煙草普通花葉病主要是由煙草花葉病毒（Tobacco Mosaic Virus，TMV）引起的，煙草花葉病毒是披蓋病毒科煙草花葉病毒屬的單鏈RNA（ssRNA）病毒，可侵染十字花科、茄科、菊科、藜科和莧科等36個科350多種植物，有寄主范圍廣、抗逆性強、生產危害大等特點[1]。感染了煙草花葉病的煙葉，烤曬后色澤不均，品質及等級均不同程度地下降[2]，是煙葉生產可持續發展中亟待解決的關鍵問題之一[3-4]。由于植物沒有完整的免疫代謝系統，而煙草花葉病毒在植物細胞中屬于絕對寄生，其復制所需的能量、物質和場所完全依賴于寄主，因此煙草花葉病毒病的防治較困難，對煙葉生產來說是一種巨大的威脅。目前，煙草花葉病毒病已上升為威脅中國煙葉生產的主要病害之一，我國南北煙區常有加大規模的病情發生，尤其以南方煙區受害較重[5]。據報道，全世界每年僅由于TMV造成的經濟損失就超過1億美元[6]。

當前，煙葉生產中煙草花葉病最常用的防治方法有選擇抗病品種、培育無毒壯苗、施用抗病毒制劑、采用農業保健栽培措施和生物防治等。然而，煙草品種具有較明顯的區域適應性，同一品種在不同地區種植其抗病特性也有差異；同時，農業栽培防治措施也僅僅起到有限的預防作用，其精細的栽培過程往往給煙農帶來沉重的負擔；因此，尋求有效的煙草花葉病毒病防控措施已成為當務之急。

植物資源廣泛，且植物是生物活性化合物的天然寶庫，植物產生的次生代謝產物超過20萬種，其中包含了大量的能有效控制植物病毒病的成分，而生物來源的抗病毒活性物質既環保又無毒副作用，已逐漸成為抗病毒藥劑研發的新方向。筆者通過提取50種植物的生物活性物質，來處理感染TMV病毒的煙株，以檢測其抑制TMV的生理效應及防治效果，旨在為植物源抗病毒類生物農藥的研制提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 共采集了云南（15種）、貴州（35種）兩省共50種植物（表1），經華中農業大學生命科學院植物學教研室鑒定并保存憑證標本。

1.1.2 供試毒源 試驗所用煙草花葉病毒由華中農業大學植物病理研究所提供，試驗前參照王人元的方法對病毒進行純化，然后將純化后的病毒進行紫外掃描，選擇呈典型的TMV核蛋白吸收曲（A260/A280=1.20）的病毒液進行接種，接種液用PBS緩沖液定容為20 μg/mL。

1.1.3 供試烤煙品種 供試烤煙品種為心葉煙（Nicotiana glutinosa L.），將心葉煙種子與一定量基質混勻后均勻灑在裝有基質的育苗盤中，澆水適量，置于適宜條件下（溫度22℃，光照16 h/d，濕度60%）培養，當幼苗長至4~6片真葉時進行試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物材料的預處理 （1）將陰干的植物材料置于恒溫烘箱內，加溫至50℃，干燥后粉碎，過40目篩，放入密封袋中備用。（2）將植物樣品用乙酸乙酯進行超聲波提取，超聲波頻率為1 200 Hz，2s/次，工作間歇 0.2 s，全程 30 min，溫度 40℃。（3）植物樣品質量與溶劑的體積比為1∶8，重復提取兩次，共計60 min。（4）將提取液過濾兩次，合并濾液進行減壓濃縮。（5）用乙酸乙酯將濃縮液定容至20 mL刻度試管中，即1 mL提取物中含有1 g干植物樣品的物質，密封后放到0~4℃冰箱中保存。（6）準確吸取5 mL植物乙酸乙酯提取液（1 g/mL），以清水加乳化劑為基質，稀釋為5倍液、10倍液、20倍液、50倍液，備用。

表1 供試植物名錄

1.2.2 防效測定 （1）TMV體外鈍化作用測定。以半葉枯斑法檢測植物提取液對TMV的體外鈍化作用。具體方法：選取健康生長旺盛的4~6葉期心葉煙左半葉接種植物提取液（50倍液）與病毒的等體積混合液，右半葉接種蒸餾水與病毒的等體積混合液（對照），重復3次。接種5~7 d后計算枯斑數，枯斑抑制率計算公式：枯斑抑制率（%）＝（對照枯斑數－處理枯斑數）/對照枯斑數×100%。（2）對TMV初侵染和復制增殖作用的測定。同樣以半葉枯斑法進行檢驗。具體方法：選取健康生長旺盛的4~6葉期心葉煙，初侵染試驗中先在供試植物左半葉涂藥，間隔一定時間后，再全葉接種病毒；復制增殖試驗中先全葉接種病毒，間隔一定時間后，再在供試植物的左半葉涂藥。植物提取液濃度為50倍液，嗎啉胍·乙銅濃度為400倍液，病毒接種濃度為10 μg/mL。各處理重復3次，5~7 d后計算枯斑數，按上述方法計算枯斑抑制率。（3）活性植物提取物質之間增效作用的測定方法。采用協同毒力指數法確定兩種植物提取液混合使用時是否具備增效作用，計算公式為：混劑理論死亡率（%）=1－（1－Pa）×（1－Pb），式中Pa、Pb分別表示各單劑的枯斑抑制率；協同毒力指數（c.f）=（實際死亡率－理論死亡率）/理論死亡率×100。當協同毒力指數＜-20時，表示兩種植物提取液表現為拮杭作用；當協同毒力指數＞20時，表示兩種植物提取液表現為增效作用；當協同毒力指數處于-20~20之間時，表示兩種植物提取液表現為相加作用。

2 結果與分析

2.1 植物提取物抗TMV的生物活性

采用50種植物提取物對TMV體外鈍化生物活性進行了研究，結果見表2。

表2 五十種植物提取物對TMV體外鈍化生物活性測定結果

從表2中可以看出，在植物提取物干重濃度為0.1 g/mL的劑量下，50種植物提取物對TMV病毒病均表現出不同程度的抑制活性。其中，乳漿大戟對TMV病毒病的抑制作用最強，枯斑抑制率高達65.66%；其次是甘草（62.12%）；蛇莓植物對TMV病毒病也表現出一定的抑制活性，枯斑抑制率達57.49%；其余47種供試植物樣品對TMV病毒病作用較弱，枯斑抑制率均＜50%。

2.2 植物提取物對心煙葉的初浸染和增殖侵染

在供試植物提取物的濃度下，選擇對TMV病毒病枯斑抑制率大于50%的3種植物進行了活性復篩，主要研究其對TMV病毒病的初侵染和復制增殖情況，其結果見表3。從表3中可知，3種植物植物提取物對TMV病毒病的體外鈍化、初浸染、復制增殖都有明顯的抑制效果，且顯著高于對照藥劑。

2.3 植物提取物兩兩組合物對心煙葉的初浸染和增殖侵染

表3 甘草、乳漿大戟和蛇莓的植物提取物對TMV病毒病的初侵染和復制增值抑制活性 （%）

對2.2篩選出的甘草、乳漿大戟、蛇莓3種抗TMV活性物質進行復配增效研究，結果（表4）表明：甘草＋蛇莓組合表現為增效作用；甘草＋乳漿大戟組合表現為相加作用；蛇莓+乳漿大戟組合表現為拮抗作用。

表4 不同植物提取物組合抗TMV的協同毒力指數

3 討論

植物作為可直接開發利用的自然資源，目前正面臨著兩大危機：（1）野生植物資源的種類和產量呈逐年下降趨勢；（2）隨著藥用植物資源需求量的不斷增加，導致一些重要的藥用植物資源常年超量采挖。因此，植物天然活性物質的生產和自然資源保護之間的矛盾日益突出。為了更好地開發和利用這些具有較高農用活性的植物，如何利用生物工程、基因工程等手段解決高農用活性資源緊缺問題的研究勢在必行。

該研究對50種植物提取物抗TMV活性的檢測不可避免的存在漏篩現象，即使在試驗中對TMV無明顯抑制效果的植物，有可能因為試驗方法的缺陷或其他原因而沒有檢測出其真實活性，對于這些在初篩過程中很難避免的問題，應在以后的研究過程中高度重視。此外，關于該研究篩選出的“甘草＋蛇莓”組合的最佳增效比，以及各成分的增效機理仍有待深入研究。

[1]翟梅枝，高芳鑾，沈建國，等.抗TMV植物的篩選及提取條件對抗病毒物質活性的影響[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2004，32（7）：45-49.

[2]朱賢朝，王彥亭，王智發.中國煙草病害[M].北京：中國農業出版社.2002.

[3]賴榮泉，賴碧添，黃光偉，等.煙草病蟲害預警防災體系的構建及其應用[C].北京：中國農業科學技術出版社，2007：808-810.

[4]上官克攀，林祥永，曾文龍，等.閩西煙區主要病害及其綜合防治技術體系[J].中國煙草科學，2006，27（1）：20-23.

[5]吳艷兵，顏振敏，謝荔巖，等.天然抗煙草花葉病毒大分子物質研究進展[J].微生物學通報，2008，35（7）：1096-1101.

[6]吳云峰.生物病毒農藥篩選及其應用[J].世界農業，1995，（5）：35-36.