選擇性激光小梁成形術對小梁網顯微結構影響及降壓機制研究

李忠強 閆小四 馬景學

病理性高眼壓是青光眼相關視神經損害的最危險因素，故降低和穩定眼內壓至靶水平是青光眼治療的首要任務。目前臨床降低眼壓的方法主要有藥物、手術和激光療法三種。氬激光小梁成形術(argon laser trabeculoplasty，ALT)可成功降低原發性開角型青光眼(primary open angle glaucoma，POAG)的眼內壓［1］，但降壓效果不持久，可能與ALT對眼前房角小梁網造成凝固性破壞并對周圍無色素細胞和組織產生熱損傷有關［2］。為解決上述問題，自1995年對選擇性作用于色素性小梁激光進行了研究，發現了倍頻Q開關Nd:YAG激光能選擇性作用于色素性小梁細胞，具有確切降低眼壓效果，對周圍組織無熱損傷和凝固作用，即選擇性激光小梁成形術(selective laser trabeculoplasty，SLT)［3］。SLT的應用為開角型青光眼患者的治療開辟了一條安全有效的新途徑。本實驗采用組織形態學觀察彌猴眼SLT術后眼前房角小梁網組織的顯微結構改變，探討SLT降低眼內壓的可能機制，使該技術在臨床上得到合理應用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康成年恒河猴6只，雌雄各3只，體重6～7 kg，年齡3～4歲。由河北醫科大學第二醫院動物室提供。術前常規眼科檢查(裂隙燈、眼底鏡、房角鏡、眼壓計)，排除眼病和前房角結構變異，房角為開角型。

1.2 主要儀器設備 裂隙燈顯微鏡(TOPCON，日本)，間接眼底鏡(Ra-200型，北京)，壓陷式眼壓計(蘇州)，手術顯微鏡(OMS610，TOPCON，日本)，Lumenis Selecta dute 激光器(美國)，Olympus顯微鏡(日本)，掃描電子顯微鏡(日立S-3500N，日本)，透射電子顯微鏡(日立H-7500，日本)，LEICA顯微照相系統(德國)。

1.3 主要溶液配制 A液:磷酸二氫鉀1.816 g溶于200 ml雙蒸水;B液:磷酸二氫鈉5.5 g溶于200 ml雙蒸水。4%戊二醛固定液配制:A液(10 ml)+B液(50 ml)+25%戊二醛原液(12 ml);2.5%戊二醛固定液配制:4%戊二醛(95 ml)+50%戊二醛原液(5 ml)。

1.4 SLT治療步驟 分別標記實驗猴1～6號，術前6 h禁食水，按每公斤體重10 mg肌內注射氯胺酮全身麻醉后行右眼愛爾卡因表面麻醉，置專用房角鏡，接受lumenis selecta dute激光器治療，采用SLT檔激光即倍頻Q-開關ND:YAG激光，照射范圍為上方180°小梁網。治療參數:波長532 nm，脈沖時間3 ns，光斑直徑400 μm，光斑相鄰但不重疊，點數50～80個。初始能量設置為0.8 mJ，以剛能看到激光照射點出現小氣泡后減少0.1 mJ為治療能量。左眼做為正常對照。術后1周，6只實驗彌猴行雙眼上方小梁切除術，小梁組織大小約2×3 mm，1、3、5號猴做掃描電鏡觀察，2、4、6號猴做透射電鏡觀察。

1.5 掃描電鏡步驟 小梁組織標本迅速放入2.5%戊二醛中固定4 h以上，雙蒸餾水浸洗4次;50%、70%、80%和90%乙醇逐級脫水，然后置入100%乙醇脫水2次，每次20 min。叔丁醇干燥，75%液20 min，100%液2次，每次20 min，真空干燥2 h;標本噴金，觀察與照相。

1.6 透射電鏡步驟 小梁組織標本迅速放入4%戊二醛前固定4～6 h，1/15 mol/L磷酸緩沖液浸洗3次以上;1%四氧化鋨后固定1～2 h;1/15 mol/L磷酸緩沖液浸洗2次，每次20 min;丙酮逐級脫水50%、70%、80%、90%、100%2次，每次15 min。之后浸透與包埋:純丙酮:包埋劑(1∶1)37℃溫箱1 h，再置入純丙酮:包埋劑(1∶3)37℃溫箱3 h以上，最后純包埋劑浸透37℃溫箱5 h以上。50 μm超薄切片，醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色，電鏡觀察與照相。

2 結果

2.1 正常彌猴眼前房角小梁網電鏡結果 正常彌猴眼前房角小梁網由基質、膠原纖維、彈性纖維和內皮細胞組成。中心為膠原纖維，埋于均勻基質中。膠原纖維間有少量彈性纖維。小梁網的表面覆蓋一層內皮細胞。內皮細胞寬而扁平，有突起，有的突起很長，與相鄰細胞連接成單層網狀(圖1)。內皮細胞中含有豐富膜樣細胞器。

2.2 SLT治療后1周小梁網電鏡結果 掃描電鏡觀察小梁網結構完整，小梁柱層次清楚，沒有見到凝固性損傷及熱損傷，只有小梁限局性的裂隙樣改變，小梁網間隙中可見較多體積較大的吞噬細胞(對照組未見)(圖2、3);透射電鏡下見色素性小梁網內皮細胞內可見部分黑色素顆粒崩解、外溢(圖4A、B)。

圖1 正常獼猴小梁網掃描電鏡，小梁網由基質、膠原纖維、彈性纖維和內皮細胞組成，結構清晰(SEM×700)

圖2 SLT后1周獼猴小梁網掃描電鏡，小梁組織限局性裂隙樣改變(箭頭)。無凝固性損傷及熱損傷改變(SEM×2 000)

圖4A 正常彌猴眼前房角小梁網透射電鏡(TEM)，色素性小梁網內皮細胞內可見密集的色素顆粒(箭頭)(TEM×20 000)

圖4B SLE后1周獼猴小梁網透射電鏡，色素性小梁網內皮細胞內部分黑色素顆粒崩解、外溢(箭頭)(TEM×20 000)

圖3 SLT后1周獼猴小梁網掃描電鏡，小梁網間隙中可見較多體積較大的吞噬細胞(箭頭)(SEM×1 200)

3 討論

開角型青光眼除傳統的藥物療法和手術治療外，還可通過激光治療降低眼壓?？骨喙庋鬯幬镏委熓且环N終身療法，不僅患者依從性差，有藥物漂移現象，且治療費用昂貴，患者常難以堅持治療，因此開角型青光眼的激光療法越來越受到重視。1979年Wise和Witter首次報告用低能量氬離子激光ALT治療POAG，其降壓機制尚無定論，一般認為是激光的熱效應使小梁纖維板層收縮，加寬了小梁間隙，同時打開了Schlemm’s管，從而減少了房水排出阻力而降低眼壓［4］。經二十余年的臨床實踐，ALT的安全性和有效性已得到臨床醫生的廣泛接受，但ALT對小梁網可造成凝固性破壞并對周圍無色素細胞和組織產生熱損傷，且在激光斑之間形成膜樣結構和瘢痕組織，從而使降眼壓效果不能持久，并限制了激光治療的重復應用和進一步藥物治療的效果［2，3，5，6］。由于上述缺點，ALT 仍不能代替抗青光眼藥物成為治療開角型青光眼的首要選擇。

為了解決上述問題，1995年Latina和Park發明了選擇性激光小梁成形術(SLT)，應用于治療POAG并取得了良好療效。SLT采用Q開關、倍頻Nd:YAG激光，脈沖時間3 ns，激光光斑400 μm，激光波長532 nm，脈沖能量小于2 mJ。選擇性作用于色素性小梁細胞，使鄰近組織不受損害，保持了小梁組織的結構完整，彌補了ALT的不足。

3.1 采用彌猴眼小梁組織標本進行SLT研究的意義 因臨床上患者接受SLT治療后短期內再行小梁切除術的病例很少，且因手術限制不能進行與自身正常小梁組織的對照，而彌猴眼小梁組織結構與人眼雖然有些差別(如其小梁較人眼短而粗)，但與人眼小梁有相似的超微結構，故我們采用猴眼小梁組織標本進行對SLT術后顯微結構的研究。本實驗之所以選擇對SLT術后1周時的猴眼小梁組織進行電鏡觀察，是因為較長時間和較多時間點的顯微觀察需要更多的實驗動物，實驗動物來源困難，數量有限，我們只能選擇炎性反應和顯微結構改變都趨于穩定的術后1周這個時間點進行觀察，這是本實驗的不足。本實驗電鏡結果表明，SLT術后掃描電鏡檢查未發現小梁網的結構破壞，未發現有凝固性損傷及熱損傷，只有局部小梁架的裂隙樣改變，小梁間隙中可見體積較大的吞噬細胞(對照組未見)。透射電鏡顯示色素性小梁內皮細胞內黑色素顆粒崩解，外溢。這與國外研究結果相同，Kramer等［7］在比較人尸體眼球SLT和ALT術后電子顯微鏡下急性形態學改變時也發現，與ALT不同，SLT術后小梁網結構完整，沒有發現凝固性損傷，機械性損傷(局部小梁斷裂)也比較少，激光的顯微證據表現為透射電鏡顯示的色素性小梁內皮細胞內黑色素顆粒崩解和小梁內皮細胞破壞。以上結果證實了Latina的說法，即SLT選擇性作用于色素性小梁細胞而對無色素細胞及周圍組織結構無熱損傷及凝固作用。

3.2 SLT的降壓機制 激光的選擇性光熱解效應理論認為，要使激光對靶組織具有高度特異性，須具備三個條件:(1)細胞內的靶物質含量遠多于周圍組織;(2)激光波長與靶組織吸收波長相符;(3)激光脈沖時間小于或等于靶組織的熱馳豫時間(即靶組織將電磁能轉化為熱能所需的時間)。SLT的治療作用就是通過上述原理實現的，它提供了產生極短的激光脈沖的物質基礎。另一方面，SLT的作用對靶組織有一定要求:(1)靶細胞內含有色素;(2)靶細胞必須比其周圍的組織容易吸收激光能量。人眼功能小梁由兩種細胞組成，即含有色素的小梁細胞和不含色素的小梁細胞。因此，人眼功能小梁提供了SLT選擇性光熱解作用的靶細胞。

從實驗結果看，SLT不同于ALT，它只選擇性作用于色素性小梁細胞，對無色素細胞和周圍組織不產生凝固性破壞和熱損傷，不會造成小梁間隙和Schlemm’s管的擴張;同時我們發現，SLT術后小梁間隙中吞噬細胞較對照組明顯增多，故我們推測SLT降眼壓的機制存在于細胞水平。巨噬細胞可以修復由于損傷、疾病和老化引起的組織改變。SLT作用于小梁網后使單核細胞和巨噬細胞數量增加，通過激活的巨噬細胞對殘留物和小梁組織色素顆粒的搬運或吞噬作用增加小梁細胞的房水外流功能。Alvarado［8］等在對猴眼的研究中發現，SLT術后猴眼小梁網的單核細胞及巨噬細胞數量較未治療眼增加5～8倍，他們認為，SLT術后引起的色素性小梁細胞損傷可導致多種細胞因子或化學因子的釋放，后者可激活單核細胞并使其轉化為巨噬細胞，而巨噬細胞可以吞噬、清除小梁組織的色素顆粒，并經Schlemm’s管運出眼外，從而達到降低眼壓的效果。也有人認為，SLT對色素細胞的損傷產生了細胞因子和趨化因子，如白細胞介素-1和腫瘤壞死因子等，這些細胞因子中的一部分在減少金屬蛋白酶中起重要作用，而后者可以改變促進房水外流的小梁網組織的細胞外基質，從而增加房水外流量［8］。

綜上所述，動物實驗研究表明，SLT對小梁組織沒有熱損傷及凝固作用，可以保留小梁組織結構的完整性，故可以重復治療，是較ALT更合理而安全的激光治療方法。

1 Wise JB，Witter SL.Argon laser therapy for open-angle giaucoma:a pilot study.Arch Ophthalmol，1979，97:319-322.

2 Alexander RA，Grierson I.Morphological effects of argon laser trabeculoplasty upon the glaucomatous human meshwork.Eye，1989，3:719-726.

3 Latina MA，Park C.Selective targeting of trabecular meshwork cells:in vitro studies of pulsed and continuous laser interactions.Exp Eye Res，1995，60:359-372.

4 劉學英.小梁切除術聯合超聲乳化治療閉角型青光眼療效分析.河北醫藥，2011，33:3625.

5 Damji KF，Shah KC，Rocr WJ，et al.Selective laser trabeculoplasty v argon laser trabeculoplasty:a prostective randomized clinical trial.Br J Opthalmol，1999，83:718-722.

6 Hollo G.Argon and low energy，pulsed Nd:YAG laser trabeculoplasty.Acta Ophthalmol Scand，1996，74:126-131.

7 Kramer TR，Noecker RJ.Comparison of the morphologic changes after selective laser trabeculoplasty and argon laser trabeculoplasty in human eyebank eyes.Ophthalmology，2001，108:773-779.

8 Alvarado JA，Alvarado RG，Yeh RF，et al.A new insight into the cellular regulation of aqueous out flow:how trabecular meshwork endothelial cells drive a mechanism that regulates the permeability of Schlemm’s canal endothelial cells.Br J Ophthalmol，2005，89:1500-1505.