兩種不同結核菌藥物敏感試驗方法比較

劉相 呂翠環 李玉靜 杜月菊 陳海峰

近幾年來，隨著耐藥結核菌逐漸增多，傳統的結核桿菌藥物敏感試驗耗時長，不利于結核患者的早期有效的治療。盡管目前有一些快速檢測結核菌藥物敏感性的方法，但由于儀器和試劑昂貴或者技術復雜很難推廣。我們利用CLSI(NCCLS)M24-A微量肉湯稀釋法原理，通過縮短藥敏試驗的時間，縮短整個結核菌培養及藥敏試驗的時間，達到快速檢測患者的耐藥情況，以便及時指導臨床用藥。本文隨機選擇100例患者分別采用快速實驗及傳統藥敏試驗方法進行對照。報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 試驗組和對照組分別隨機抽取50例。試驗組男38例，女12例;年齡9～84歲，平均年齡40歲。對照組男27例，女23例;年齡13～78歲，平均年齡32歲。標本來源:痰液、氣管鏡灌洗液、針吸物、胸水、手術標本等。

1.2 方法

1.2.1 2組采用同樣的方法進行前期的處理和培養。藥敏試驗試驗組接種在快速藥敏培養基，對照組接種在傳統的羅氏藥敏培養基。快速藥敏培養基及快速藥敏試驗肉湯培養基均由試劑廠家提供，改良羅-氏培養基及傳統藥敏用培養基均由本科室按結核病診斷細菌學檢驗規程自制。快速藥敏實驗的原理:根據CLSI(NCCLS)M24-A微量肉湯稀釋法原理，將藥物包括菌群分類藥物事先包被在U-底板上，將結核菌研磨比濁，以培養基稀釋后加入測試孔，根據各孔的情況獲得MIC數據成界值范圍，以此判斷藥物敏感性。

1.2.2 培養:研究病例均以晨痰用4%NaOH液消化15 min，PBS緩沖液平衡離心，取沉淀物分別接種于BD公司生產的液體快速結核菌培養基及改良羅氏培養基，經37℃恒溫培養獲得，快速培養基報陽經涂片確認，羅氏培養基經2～8周出現菌落涂片確認為分支桿菌。

1.2.3 藥敏試驗:凡培養陽性者均做統一抗結核藥物藥敏試驗。試驗組:常用藥物及濃度:鏈霉素(Sm):1、2、4、8 μg/ml;異煙肼(Inh):0、2、0.4、0.8、1.6 μg/ml;利福平(Rfp):1、2、4、8 μg/ml;乙胺丁醇(Emb):2、4、8、16 μg/ml;氧氟沙星(Ofx):2、8 μg/ml;左氧氟沙星(Lfx):2、8 μg/ml;阿米卡星(Am):1、4 μg/ml;卷曲霉素(Cm):2.5、10 μg/ml;丙硫異煙胺(Pto):10、40 μg/ml;力克肺疾(Dpc):0.5、2 μg/ml;莫西沙星(Mfx):0.5、2 μg/ml，環 丙 沙 星 (Cip):1、4 μg/ml;克 拉 霉 素 (Cir):4、16 μg/ml;利福布丁(Rfb):0.75、3 μg/ml;利奈唑胺(Lz):2、8 μg/ml;氯法齊明(Cio):0.5、2 μg/ml。用于菌型鑒定藥物濃度為:TCH C2—羧酸肼噻吩0.25 μg/ml，PNB對硝基苯甲酸400 μg/ml。對照組:常用藥物及濃度:Sm:10、100 μg/ml;Inh:1、10 μg/ml;Rfp:50、250 μg/ml;Emb:5、50 μg/ml;對氨基水楊酸鈉(Pas):1、10 μg/ml;Dpc:1、10 μg/ml;LFV:2、20 μg/ml。藥物來源均由住院藥房提供，與患者用藥一致。用于菌型鑒定的培養基及濃度為:C2—羧酸肼噻吩(TCH)100 μg/ml)，對硝基苯甲酸(PNB)500 μg/ml。

2 結果

2.1 獲得結果的時間 試驗組大部分接收標本以后20～30 d可以獲得藥物敏感實驗結果，平均26.3 d，其中小于20 d，對照組大部分在50 d以上，30 d以內未獲得藥物敏感實驗結果。見表1。

表1 2種不同方法獲得結果的時間分布 n=50，例

2.2 耐單藥分布 試驗組在藥物的組合上比對照組多了6種，對于耐藥結核菌而言尤其有意義，藥物濃度也發生改變，比對照組的藥物類型多，而且濃度由原來的2種，變成4種，有利于藥物的選擇。見表2。

表2 2種不同方法試驗藥物分布 n=50，種

3 討論

經典“慢培”方法依靠雞卵為基礎的固體表面培養技術，如羅氏、Ogawa等培養基。其優點是成本低，能分離到單個菌落，通過菌落形態的觀察鑒定細菌。缺點是生長緩慢，周期長，平均49.6 d，最快42 d，藥敏試驗需要4周時間。“快培”方法:以BD公司BACTEC MGIT960為代表的以液體培養基為基礎結合儀器信號捕獲的快速分離培養，獲得生長數據。分離周期短，結核分枝桿菌的平均檢出時間為26.3 d，最快18 d，快速藥敏試驗培養平均檢測時間一般為7～14 d，比羅氏早2～3周。

快速藥敏試驗培養7～14 d出結果，傳統藥敏試驗培養4周出結果。以BD公司 BACTEC MGIT960為液體培養基的結核菌培養縮短了培養的時間，以CLSI(NCCLS)M24-A肉湯培養基為基礎的增菌培養基的結核分枝桿菌快速分離培養技術縮短了藥敏試驗的培養時間。BD公司BACTEC MGIT960為液體培養技術及結核分枝桿菌快速分離培養技術在實驗室的應用，縮短了結核菌的培養及藥敏試驗的時間，使結果更快速準確，更及時的服務于臨床，對患者的治療，起到積極的作用。

通過對兩種試驗方法的比較，可以看出，試驗組比傳統對照組藥敏試驗時間明顯縮短，對于難治性肺結核患者尤其重要，可以在短時間內指導臨床及對患者的用藥規范，使患者盡快恢復健康。常用藥物只有2種藥物濃度，而快速藥敏試驗對于常用藥物增加了藥物的濃度，常用藥物增至4個藥物濃度，更精確。該方法為CLSI(NCCLS)推薦的M24-A標準微量肉湯稀釋法(Microbroth Dilution Method)藥敏試驗方法，需要的菌量少，速度快，數據全，7～14 d內提供16種藥物藥敏及分群鑒定數據，使合理用藥成為現實。